Le protocole FASP est une approche intéressante de votre protéomique urinaire en raison de sa compatibilité avec les tampons fortement dénaturants et en raison de sa capacité à concentrer l’échantillon sur le filtre, ce qui est essentiel pour un échantillon de protéines diluées. Le protocole FASP couplé avec la spectrométrie de masse d’analyse indépendante des données nous permet d’atteindre une couverture protéométrique profonde dans l’EPS-urine, qui est l’urine recueillie après examen rectal numérique. Nous appliquons actuellement la méthode que vous êtes sur le point de voir dans un effort de découverte de biomarqueurs sur le cancer de la prostate.
La procédure sera présentée par Licia Prestagiacomo, Paola Morelli et Caterina Gabriele. Centrifugeuse EPS-urine échantillons dans les deux heures de collecte pendant 10 minutes à 2100 RCF à température ambiante. Ensuite, conservez les supernatants à moins 80 degrés centigrades jusqu’à utilisation.
Jetez les échantillons sur la glace, ou à quatre degrés. Pour accélérer la procédure, vous pouvez transférer les échantillons de moins 80 à moins 20 la veille de la digestion. En tant que solutions de stock, vous aurez besoin de 500 millimolar DTT, 10%SDS, un tampon tris molaire au pH huit.
Diluer 500 microlitres de chaque échantillon d’EPS-urine avec 67 microlitres de SDS, 67 microlitres de TNT et 33 microlitres de tampon Tris. Incuber à 95 degrés centigrades pendant 10 minutes avec des secousses douces. Assembler l’unité de filtre centrifuge avec une coupure de poids moléculaire daltonien de 10 000 daltoniens.
Ajouter ensuite 300 microlitres d’échantillon dilué d’EPS-urine au filtre. Centrifugeuse à 14 000 g pendant environ 20 minutes. Vous pouvez interrompre temporairement la procédure après environ 15 minutes afin de vérifier si la filtration se déroule sans heurts.
Continuez jusqu’à ce que toute la solution soit passée à travers le filtre. Ensuite, ajouter 200 microlitres de tampon d’urée et de centrifugeuse à 14 000 g pendant 15 minutes. Répétez cette étape une deuxième fois.
Lorsque le flow-through est sur le point de toucher le filtre, vider la collection Eppendorf en pipetting le flux à travers. Les protéines sont sans danger sur le filtre. Pour l’alkylation cystéine, préparer une solution d’iodoacétamide immédiatement avant l’utilisation.
Pesez environ 10 milligrammes d’iodoacétamide dans un certain nombre de flacons d’Eppendorf et dissolvez-le dans le tampon d’urée à une concentration de 9,25 milligrammes par ml, ou en termes de molaire, 50 millimolaire. Ajouter 50 microlitres de solution d’iodoacétamide à chaque filtre et centrifugeuse à 6000 g pendant 25 minutes. La vitesse de centrifugation inférieure permettra aux filtres de ne pas sécher.
Après l’alkylation des protéines, laver les filtres avec deux aliquots de 200 microlitres consécutifs de tampon d’urée et de centrifugeuse à 14 000 g pendant 20 minutes. Jetez le flux à travers. Ajouter 200 microlitres de 50 millimillons trois tampons et centrifugeuses en ammonium éthylique à 14 000 g pendant 20 minutes.
Répétez cette étape. Après avoir terminé complètement le dernier lavage au bicarbonate, transférez l’unité de filtre dans un nouveau tube de collecte. Ajouter ensuite 60 microlitres de tampon TEAB de 50 millimères.
Ajouter un microlitre de solution trypsine à une concentration de 200 nanogrammes par microlitre de trypsine. Vous pouvez également préparer le tampon de digestion pour tous les échantillons dans un flacon d’Eppendorf et distribuer 61 microlitres du tampon de digestion à chaque filtre. Si vous utilisez un ThermoMixer afin d’éviter l’évaporation de l’échantillon pendant l’incubation pendant la nuit, enveloppez chaque unité de filtre avec une couche de papier d’aluminium, puis une couche de parafilm.
Incuber les échantillons à 37 degrés pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez les filtres sur une centrifugeuse du dessus du banc pour une rotation très courte. Après avoir tourné, ouvrir les couvercles d’Eppendorf et ajouter 140 microlitres d’eau.
Centrifugeuse les flacons à 14 000 g pendant 25 minutes, afin de recueillir les peptides. Le volume recueilli devrait être d’environ 190 microlitres. Afin d’éliminer les traces de SDS du digeste, une forte purification d’échange de cation des peptides avant LC-MS-MS est recommandée.
Préparez les supports en microcolumn en perçant les couvercles Eppendorf avec un outil pointu comme une paire de pinces ou de ciseaux. Le support pourra accueillir le microcoumn pendant la centrifugation. Puisqu’ils sont fastidieux pour préparer, les supports peuvent être utilisés plusieurs fois.
À l’aide d’un émoussé et d’une aiguille, retirer une plaque du disque d’extraction approprié. Les disques d’extraction sont des matériaux polymériques mous contenant des particules sorbentes. Dans ce cas, le sorbent est fait de particules avec de fortes propriétés d’échange de cation.
Accueillir la plaque dans une pointe de pipette de 200 microlitres. À l’aide d’un piston, poussez la prise vers l’extrémité de la pointe. Le petit disque doit être poussé fermement, mais en évitant une force excessive.
Insérez la pointe dans le support et assemblez le microcoumn spin à l’aide d’un flacon Eppendorf de deux millilitres à partir duquel le couvercle d’origine a été retiré. La prise à partir d’une aiguille de jauge 16 aura une capacité de chargement d’environ cinq microgrammes de peptides. Conditionner le microcoumn avec deux lavages consécutifs.
La vitesse appropriée dépendra de la force avec laquelle vous poussez le disque dans la pointe pipette. Visez à atteindre un débit de l’ordre de 20 à 30 microlitres par minute. Essayez de ne pas faire sécher la pointe pendant les lavages et pendant le chargement de l’échantillon.
Diluer l’échantillon cinq fois dans la solution de lavage deux et charger les résultats dans la solution à une vitesse plus lente. Visez un débit d’environ 15 à 20 microlitres par minute. Si nécessaire, jetez le flux.
Laver les détergents résiduels. Ensuite, laissez le disque sécher avant l’élitution peptidique. Transférer le microcoumn dans un tube propre de 1,5 Eppendorf et ajouter immédiatement l’élitiste.
Qui sera sept microlitres d’une solution d’acétate d’acétate de munitions de 500 millimlaires contenant 20% d’acétylonitrile. Diluer l’élixate avec 27 microlitres d’acide 0,1% formic afin de réduire le pourcentage de solvant organique, puis injecter deux microlitres de la solution résultante dans LC-MS-MS avec détection en mode dépendant des données. Les détails sur la configuration LC-MS utilisée dans ce protocole seront donnés plus tard dans la vidéo.
Après avoir effectué la recherche de base de données et l’intégration des erreurs peptidique, calculez la zone de pointe globale. Ensuite, comparez-le à une courbe standard externe pour estimer la concentration de peptide dans le digeste FASP. Après avoir estimé la quantité de peptide, purifier un nouvel aliquot de fasp digest correspondant à deux microgrammes de peptides par deux purifications consécutives stageTip comme décrit ici.
La configuration LC-MS utilisée dans ce protocole est basée sur l’injection directe dans la colonne analytique. Si vous utilisez un système avec une colonne de piégeage, vous pouvez éviter l’étape de purification hors ligne C18. N’oubliez pas d’utiliser des aiguilles et des pistons dédiés pour chaque matériau chromatographique.
Après avoir éludé les peptides de la pointe de l’étape C18 avec 10 microlitres d’élitent, évaporez partiellement l’élitate dans une centrifugeuse sous vide pendant quelques minutes, en essayant d’éviter l’évaporation complète. Ensuite, ajoutez 47 microlitres d’acide formique de 0,1 % et placez la solution qui en résulte dans un flacon HPLC pour l’analyse LC-MS. Le système utilisé ici est basé directement sur le chargement de l’échantillon de colonne sans utiliser une colonne de piégeage.
Les colonnes analytiques sont faites à l’interne en tirant un capillaire d’identification de 75 micromètres après avoir enlevé un morceau de revêtement en polyamide. La pointe qui en résulte peut être légèrement formée à l’aide d’un coupeur en céramique. Le capillaire est ensuite placé dans une bombe d’emballage et emballé avec un lisier isopropanol de 50 milligrammes par ml de C18 trois micromètres de particules de phase stationnaire.
Une pression de gaz comprise entre 10 et 20 barres d’azote ou d’hélium est nécessaire. Vous pouvez utiliser des colonnes de chromatographie alternatives ou commerciales fonctionnant au débit de sous-microlitre par minute. Assemblez la colonne sur un morceau de T.
Les deux autres extrémités sont reliées à l’alimentation à haute tension et à la boucle HPLC. Évaluez la tension optimale de pulvérisation en exécutant le système au débit isocratique. Ensuite, commencez votre analyse.
Séparez les peptides sur un gradient chromatographie de deux heures tel qu’il est affiché. L’acquisition de données consistera en une analyse rapide du service complet de SP suivie de 26 analyses MS-MS sur des fenêtres précurseurs de largeur variable. À partir de 20 m/z de largeur, pour les 20 premières fenêtres qui couvriront une plage de m/z de 350 à 750 Thompson.
Puis passer à une largeur de 50 m/z pour les cinq fenêtres suivantes et se terminer par un seul balayage MS-MS, ayant une largeur d’isolement de 200 Thompson. Des largeurs plus étroites représentent une région plus peuplée du spectre en termes de présence de précurseurs peptidiques. Pour l’analyse DIA, vous aurez besoin d’une bibliothèque spectrale.
Afin de générer une bibliothèque spectrale, vous pouvez effectuer quelques expériences dépendantes des données sur le même système LC-MS-MS que vous avez utilisé pour l’acquisition dia en utilisant le même gradient chromatographie. La fractionnement de l’échantillon augmentera la couverture protéome. Les conseils d’étape peuvent être utilisés pour la fractionnement de l’échantillon.
L’échange fort de cation et la phase inverse de base sont deux alternatives valides. Commencez par les 10 microgrammes d’un pool de plusieurs digestes FASP. Acidifier l’échantillon à l’aide d’une concentration finale de 0,2 % de l’AFE.
Chargez les peptides sur des pointes d’étape C18 de grande capacité. Utilisez plusieurs disques en cas de quantités élevées de peptide. Pour 10 microgrammes de matière, deux disques sont recommandés.
Effectuez la purification C18 comme décrit précédemment. Préparez plusieurs flacons pour une collection d’éludage. Autant que le nombre de fractions.
Dans ce cas, 10 fractions sont produites par elution stepwise. Après le dernier lavage, ajouter 20 microlitres du premier élitiste. Hydroxyde d’ammonium de 0,2%, TEAB de 10 millimlaires, 4% acétyonitrile.
Après avoir complètement élucidé la première fraction dans le premier Eppendorf, déplacez la pointe de scène vers le flacon de collection suivant. Diluer en 20 étapes de microlitres en utilisant comme eluent, 0,2% de l’hydroxyde d’ammonium, 10 millimolaire TEAB, puis augmenter la quantité d’acétylonitrile. Après avoir fractionné l’échantillon et réalisé des expériences dépendantes des données sur chaque fraction, générer votre bibliothèque spectrale par recherche de base de données des données MS-MS.
La bibliothèque sera ensuite importée dans un logiciel capable d’analyse de données DIA pour la quantification des protéines sur la base d’un minimum d’un peptide unique attribué par un minimum de trois transitions. Attendez-vous à couvrir un large éventail de protéome urinaire. Ce chiffre montre l’identification et la quantification des protéines dans une fourchette d’abondance, couvrant cinq ordres de grandeur.
Le workflow présenté ici combine l’avantage de concentration et la polyvalence du protocole FASP avec la sensibilité du mode de numérisation DIA. Cette combinaison fournit une carte riche du protéome urinaire. Étant donné que notre configuration d’analyse n’inclut pas l’utilisation d’une colonne de piégeage, le digest FASP a été purifié par un échange de cation fort et des conseils de phase inversée.
L’étape étapes inversées Conseils d’étape peut être omise lorsqu’une colonne de piégeage est connectée directement à la colonne analytique. L’utilisation de ce flux de travail est recommandée pour l’analyse des échantillons d’EPS-urine, mais son utilisation peut être étendue à la protéomique urinaire en général.
