Ici, nous présentons le protocole pour l’utilisation de l’éthanol comme solvant pour extraire et caractériser la propolis verte taïwanaise qui inhibent l’activité antibactérienne. Ce protocole est une méthode fiable et reproductible pour déterminer la qualité de la propolis verte taïwanaise. Chun’Ting Chen et Yi’Hsuan Chien, doctorants de mon laboratoire, feront la démonstration.
Pour commencer, peser 100 grammes de propolis verte taïwanaise. À l’aide d’un broyeur à épices, moudre la propolis en s’assurant que les morceaux sont broyés en poudre fine sans grosses particules. Élisez cinq flacons et ajoutez 100 millilitres de diverses concentrations d’éthanol dans l’eau à chacun.
Mélanger 10 grammes de propolis moulue dans la solution d’éthanol dans chaque flacon et incuber à 25 degrés Celsius en secouant à 250 rpm pendant 48 heures. Après cela, utilisez du papier filtre avec une taille de pore de 25 micromètres pour filtrer les extraits d’éthanol. À l’aide d’une fiole volumétrique, reconstituer les filtrates à leur volume d’origine de 100 millilitres avec 95 % d’éthanol.
Conserver les extraits reconstitués à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Lorsque vous êtes prêt à préparer les extraits pour HPLC, utilisez l’évaporation sous vide pour concentrer 10 millilitres de chaque extrait à 40 degrés Celsius pendant 10 minutes. Cuire la matière sèche à 45 degrés Celsius pendant 24 heures.
Puis, reconstituer chaque échantillon de matière sèche avec 10 millilitres de 95% d’éthanol. À l’aide d’un filtre seringue d’une taille de pore de 0,22 micromètre, refilter chaque extrait et recueillir le filtrate pour analyse directe avec HPLC. Pour commencer à établir une courbe standard, préparez un litre de la solution de méthanol de phase mobile à la solution d’eau à un rapport de 88,8 à 11,2.
En utilisant la solution de phase mobile comme solvant, préparez des dilutions périodiques des concentrations standard de propolin décrites dans le protocole de texte. Injectez 20 microlitres de chaque concentration standard dans les colonnes de phase inverse séquentiellement de la concentration la plus basse à la plus élevée. Ensuite, réglez la colonne HPLC à 30 degrés Celsius, réglez la longueur de renonciation du détecteur UV à 280 nanomètres, et le débit à un millilitre par minute, et le temps d’enregistrement à 20 minutes.
Analyser les normes au moins trois fois. Après cela, utilisez un logiciel de feuille de calcul pour brancher la réponse de mesure contre la concentration résultant en une courbe standard avec une équation déterminée et une valeur au carré R. Pour commencer à analyser les extraits, injectez 20 microlitres de chaque extrait dans la colonne de phase inverse.
Réglez la colonne HPLC à une température de 30 degrés Celsius et à un débit d’un millilitre par minute. Réglez la longueur de renonciation du détecteur UV à 280 nanomètres, et le temps d’enregistrement à 20 minutes. Analyser les extraits au moins trois fois.
Ensuite, utilisez la courbe standard pour déterminer la concentration de propolin dans chaque extrait d’éthanol. Après avoir préparé les organismes d’essai et les extraits d’éthanol, ajouter 10 microlitres d’extrait dilué d’éthanol, allant de 0,156 à 640 microgrammes par millilitre dans les puits d’une plaque de puits de 96 puits. Utilisez le bouillon pour ajuster le volume de chaque puits à 100 microlitres en s’assurant de maintenir 5% DMSO dans toutes les dilutions.
Ensuite, inoculer 100 microlitres de culture bactérienne dans chaque puits de la plaque de puits 96. Culture à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Utilisez un lecteur de microplaque à 590 nanomètres pour analyser la croissance bactérienne en fonction de la turbidité et pour déterminer la concentration inhibitrice minimale.
Après cela, inoculer 10 microlitres de culture liquide de chaque puits qui a montré à la croissance sur une plaque d’agar. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Identifier la concentration la plus faible qui n’a révélé aucune croissance bactérienne visible pour déterminer l’activité bactérienne.
La concentration qui a complètement éliminé la croissance cellulaire est considérée comme la concentration bactérienne minimale. Dans cette étude, la propolis verte taïwanaise est extraite avec de l’éthanol. Le rendement en matière sèche semble être le plus élevé lorsqu’une forte concentration d’éthanol est utilisée, et la plus faible lorsque l’eau est utilisée.
Ces résultats indiquent qu’un solvant organique est le plus performant au cours de cette extraction et que le rendement est positivement associé à la concentration d’éthanol. De même, la concentration de propolins semble être positivement associée à la concentration d’éthanol pendant l’extraction, le rendement le plus élevé de propolins étant obtenu dans les extraits d’éthanol à 95 % et 99,5 %. Les effets antibactériens des extraits d’éthanol contre l’aureus S et E coli sont ensuite étudiés.
La concentration minimale moyenne d’inhibiteurs de l’aureus S semble se situer entre 10 et 20 microgrammes par millilitre et la concentration bactérienne moyenne semble être de 20 microgrammes par millilitre. Les extraits d’eau, cependant, n’ont eu aucun effet antibactérien contre S aureus. Aucun effet antibactérien n’est observé pour E coli lors de l’utilisation de l’eau ou des extraits d’éthanol.
L’une des principales procédures expérimentales est d’édndre l’uniformité de la propolis verte taïwanaise pendant le broyage.
