L’échange de régions de protéines structurellement similaires pour créer des kimeras nous permet d’étudier l’importance des régions responsables des fonctions biologiques de la molécule à étudier. Les échanges régionaux précèdent la structure secondaire générale de la protéine afin que l’importance de la région pour sa structure globale puisse être distinguée de celles qui médiationnt directement les fonctions biologiques. Il peut se transformer en sélectionner les régions exactes à remplacer.
En commençant par de plus grands échanges est généralement utile pour identifier les fonctionnalités clés de la protéine. Pour commencer la procédure, sélectionnez une protéine appropriée en tant que donneur pour échanger des régions avec la protéine d’intérêt telle que détaillée dans le protocole du texte. Ensuite, obtenez les séquences d’acides aminés protéiques du receveur et des protéines du donneur à partir de la base de données de la séquence de référence en accédant d’abord à la section génétique de la page Web ref seq.
Tapez le nom de la protéine d’intérêt dans la boîte de recherche et cliquez sur la recherche. Cliquez sur le nom du gène de l’espèce désirée dans la liste qui en résulte. Faites défiler vers le bas à la section ref seq pour voir tous les isoformes documentés.
Cliquez sur l’identificateur de séquence pour l’isoforme d’intérêt. Faites défiler vers le bas et cliquez sur cds pour mettre en évidence la région de codage des protéines du gène. En bas à droite de l’écran, cliquez sur FAFSDA et copiez la séquence génétique.
Enregistrez la séquence d’ADN à l’aide d’un logiciel d’édition d’ADN approprié. Lorsque vous utilisez l’APE librement disponible, ouvrez le programme, coller la séquence copiée dans la boîte blanche, sélectionnez le nom de la séquence et cliquez sur enregistrer. Maintenant, choisissez les régions protéiques à remplacer dans les différentes constructions kimériques en divisant d’abord la séquence protéique d’intérêt dans des régions structurelles distinctes.
Pour ce faire, téléchargez les données structurelles de la protéine d’intérêt à partir du site Web de PDBe. Accédez à la page PDBe pour la protéine et téléchargez le fichier PDBe en cliquant sur télécharger sur le côté droit de l’écran. Ouvrez le fichier PDBe dans un système de visualisation moléculaire, comme Pymol.
Dans Pymol, affichez la séquence nucléotide, masquez les données structurelles par défaut et sélectionnez la vue cartoon pour visualiser clairement les caractéristiques structurelles de la protéine. Cliquez sur la séquence nucléotide en haut de l’écran pour mettre en évidence différentes parties de la molécule, en notant les acides aminés correspondant à chaque caractéristique structurelle distinctive. Maintenant, annotez les régions structurelles distinctes sur la séquence d’ADN dans APE en ouvrant la séquence d’ADN, en la sélectionnant, et en cliquant sur orfs traduire, puis cliquez sur le dernier acide aminé de la première région pour mettre en évidence sa position dans la séquence d’ADN et de sélectionner le codage du nucléotide pour cette région.
Cliquez à droite sur la sélection et sélectionnez la nouvelle fonctionnalité pour lui donner un nom et une couleur. Répétez le processus pour chaque région structurelle identifiée dans l’étape précédente. Pour aligner les séquences de résidus des deux protéines, d’abord, obtenir les séquences complètes d’acides aminés des protéines des donneurs et des récepteurs dans l’APE.
Comme auparavant, ouvrez la séquence d’ADN du donneur, sélectionnez-la et cliquez sur les ORF pour traduire. Ensuite, accédez à la page Web Clustal Omega, puis mettez les séquences d’acides aminés des deux protéines. Chaque séquence doit être procédée par une ligne de texte avec le nom de protéine pour être correctement identifiée.
Faites défiler vers le bas et cliquez sur soumettre. Récupérez le fichier d’alignement en cliquant sur l’onglet fichier d’alignement de téléchargement et enregistrez-le. Ce fichier peut être ouvert par n’importe quel programme d’édition de texte.
En utilisant le fichier d’alignement comme référence, annoter les régions structurelles correspondantes de la protéine donneur dans leur séquence d’ADN. Créez une copie de la séquence d’ADN annotée de la protéine récepteur et renommez-la comme une protéine kimérique. Ouvrez la séquence d’ADN rebaptisée en APE.
Sélectionnez la région à échanger dans la protéine donatrice, puis sélectionnez la région correspondante dans la protéine récepteur rebaptisée. Coller la séquence d’ADN des protéines donneurs, puis enregistrer les changements. Concevez les amorces terminales à l’aide d’un éditeur d’ADN tel qu’APE.
Créez un nouveau fichier ADN, lancez l’amorce terminale finale avec une séquence de leader. Suivi du premier site de restriction sélectionné dans les vecteurs MCS et de l’espaceur optionnel dans les 18 à 27 paires de base initiales du gène d’intérêt. Dans le nouveau fichier ADN, concevez la séquence d’amorce terminalE C pour commencer avec les 18 à 27 paires de base finales du gène d’intérêt suivies d’un espacement optionnel, du deuxième site de restriction choisi et de la séquence de leader.
Mettez en surbrillance l’ensemble de la séquence, cliquez à droite et sélectionnez le compliment inversé pour obtenir l’amorce inverse. Maintenant, les amorces de conception pour chacune des régions frontalières dans les constructions kimériques. Dans la séquence d’ADN du kimera, mettre en évidence une région de 30 paires de base dans la zone où les séquences originales et insérées sont en contact.
Il est composé de 15 paires de base dans chaque séquence. Copiez la région et coller dans un nouveau fichier ADN. Cette séquence sera l’amorce avant.
Faites une copie de l’amorce avant générée dans l’étape précédente, et renommez-la comme l’amorce inverse. Mettez en surbrillance la séquence d’amorce, cliquez à droite et sélectionnez le compliment inverse pour générer la séquence d’amorce inverse. Répétez ces étapes pour chaque zone de contact dans la séquence d’ADN kimérique.
En général, deux ensembles d’amorce inversée avant sont nécessaires pour produire un kimera, à moins que le remplacement ne se produise dans les régions terminales N ou C. Préparez un mélange individuel de réaction PCR pour chacun des fragments composant la protéine kimérique. D’abord mis un tube de microfuse d’un point cinq mililiter sur la glace et pipet les différents réacheminements des mélanges PCR dans l’ordre énuméré dans le protocole de texte.
Assurez-vous que des amorces et des modèles corrects sont utilisés pour chaque réaction PCR. Étiquetez deux minces tubes PCR à zéro paroi deux mililiter pour chaque réaction et transférez 20 microlitres du mélange PCR correspondant dans chaque tube. Transférez les tubes PCR dans un thermocycleur PCR et lancez le protocole tel que détaillé dans le protocole texte.
Une fois la réaction PCR terminée, ajouter quatre microlitres de six tampons de chargement d’ADN x dans chaque tube. Insérez le gel agaross d’un pour cent dans une unité d’électrophoresis et couvrez-le d’un tampon TAE. Chargez soigneusement les échantillons dans le gel avec un dernier poids moléculaire.
Après avoir fait fonctionner le gel de 80 à 120 volts pendant 20 à 45 minutes, éteignez l’unité d’électrophoresis et retirez le gel agoross. Visualisez les bandes d’ADN amplifiées sous la lumière UV. À l’aide d’une lame de rasoir, découpez les fragments d’ADN individuels du gel et transférez-les sur deux tubes de microfuse de mililiter étiquetés.
Après avoir utilisé une trousse de nettoyage PCR pour purifier les fragments d’ADN, quantifier la quantité d’ADN récupérée en mesurant l’absorption des échantillons à 260 nanomètres et 340 nanomètres dans un spectrofétomètre. Maintenant, effectuez l’amplification pcr pour générer la séquence d’ADN kimérique. Tout d’abord, mettre en place 50 microlitres d’une réaction PCR pour fusionner les constituants séparés de la kimera comme avant.
Utilisez les amorces terminales N et C ainsi que 10 nanogrammes de chacun des fragments d’ADN amplifiés. Récupérer et quantifier le fragment d’ADN purifié comme avant, dans 30 microlitres d’eau libre du noyau. Ce fragment contient la séquence d’ADN kimérique flanquée des sites de restriction inclus dans les amorces terminales.
La génération d’une protéine kimérique est illustrée avec deux membres de la famille inter luke et six sytokine. Oncostaten M dans le facteur inhibiteur de leucémie. L’OSM soulève kimera résulte de l’échange de la région de boucle bc de l’OSM avec une séquence de levage correspondante.
La première étape d’amplification de PCR s’est composée de trois réactions distinctes. Le fragment OSM n-terminal, qui nécessitait l’avant du terminal N OSM et les amorces inversées de démarrage BC, utilisait OSM comme modèle. La boucle du FRV BC a été obtenue par l’entremise de bc start forward et bc n reverse primers utilisant le LIF comme modèle.
Le fragment OSM du terminal C utilisait les amorces inversées de l’avant et du terminal C de la Colombie-Britannique, ainsi que l’OSM comme modèle. Ces fragments purifiés ont ensuite été utilisés comme modèle dans la deuxième réaction PCR avec les amorces inversées OSM en phase N-terminal et C-terminal OSM pour amplifier la séquence correspondante du gène OSM LIF BC loop gene. Après purification et transformation en e-coli, les plasmides individuels ont été isolés et examinés par digestion d’enzyme de restriction pour l’insertion appropriée du fragment d’ADN.
Gel électrophoresis a révélé des coups positifs qui ont ensuite été envoyés pour vérification de séquence. Les protéines kimériques doivent être produites et l’activité mesurée dans un système de factionnalité parfait. Afin de déterminer l’importance des régions remplacées pour cette faction particulière.
Cette technique a été très utile et fréquemment appliquée, interféré des récepteurs signalifs afin d’identifier les domaines de fonction clés et les sites de reconnaissance des récepteurs. Le numéro que j’utilise pour l’électrophorésie de l’ADN doit être manipulé à l’aide de gants jetables, d’un manteau de laboratoire et de lunettes de protection.
