Ce protocole est important car il permet de visualiser non seulement si une séquence d’amplificateur peut conduire l’expression, mais aussi où elle peut conduire l’expression dans une partie particulière du corps. C’est rapide. Les injections prennent moins de 10 minutes, et si et où un gène rapporteur est exprimé peut être vu dans les quelques jours seulement suivant le prélèvement de l’échantillon.
Pour commencer le clonage, choisissez ou concevez une construction de rapporteur. La construction utilisée ici place le candidat amplificateur dans les trois régions premières non traduites d’un gène rapporteur EGFP exprimé sous le contrôle du promoteur minimal hsp68. Pour concevoir les amorces de PCR permettant d’amplifier une séquence d’intérêt et de cloner dans le vecteur, ajoutez le bras d’homologie approprié pour le clonage de Gibson à l’extrémité première des amorces.
À l’aide des amorces conçues, effectuez une PCR à partir d’un échantillon d’ADN. Digérer un à 10 microgrammes d’ADN vectoriel en utilisant Pac1 et Asc1, selon le nombre souhaité de réactions de clonage requises. En utilisant une électrophorèse sur gel de 0,7 à 1% pendant 30 à 60 minutes à 100 volts, séparez les fragments de condensation de restriction.
Extrayez la bande pour le vecteur linéarisé et purifiez-la avec un kit d’extraction de gel commercial. Une fois le clonage de Gibson et la transformation des cellules terminés, plaquez les cellules sur des milieux sélectifs et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Après avoir vérifié le clonage réussi de la construction du rapporteur, inoculer cinq millilitres de la culture de démarrage en utilisant le stock de glycérol.
Cultivez la culture pendant huit à 16 heures dans un incubateur à secousses à 30 degrés Celsius et 180 rotations par minute. Lorsque le bouillon devient trouble, diluez la culture de démarrage 1 000x dans 250 à 300 millilitres de bouillon LB sélectif frais et incuberez-la pendant la nuit dans un incubateur à agitation à 30 degrés Celsius et 180 rotations par minute. À l’aide d’un kit maxi plasmidique commercial, purifiez le plasmide.
Pour tester la recombinaison des RTI, effectuez une digestion Xma1. Visualisez les bandes. Assurez-vous que votre résumé indique le nombre de bandes attendu.
La recombinaison se traduira par moins de bandes que prévu. Préparer le mélange AAV recombinant pour l’administration. Si vous comparez les profils d’expression de plusieurs virus rapporteurs amplificateurs, diluez chaque virus pour assimiler les titres de virus au virus le moins concentré.
Mélanger le virus rapporteur amplificateur et le virus rapporteur de contrôle exprimé de manière constitutive dans un rapport de deux à un ou de trois à un. Ajouter une petite quantité de colorant vert rapide avec une concentration finale de 0,06%Casser l’embout d’une pipette en verre tiré fabriquée à partir d’un tube capillaire gradué d’un microlitre en le perçant doucement dans une lingette délicate non pelucheuse. Insérez la pipette dans un ensemble d’aspiration à l’aide d’un dispositif d’application de pression relié à un joint en caoutchouc pour maintenir une pipette microcapillaire.
Aspirez un petit volume d’environ 0,2 à 0,5 microlitre d’huile minérale dans la pipette en appliquant une pression négative à travers l’aspirateur. Gardez l’appareil d’aspiration de côté et placez le virus sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être injecté. Après avoir cryo-anesthésié les souris néonatales, appliquez une pression négative à l’aide de l’ensemble aspirateur et aspirez le mélange de virus dans la pipette en verre tiré jusqu’à ce que le ménisque dépasse la marque de deux microlitres.
Éloignez la souris de la chambre froide et placez-la sur le plan de travail. Situez les sites d’injection bilatérale à mi-chemin entre le lambda et le bregma, ainsi que la suture sagittale et chaque œil. Désinfectez-les à l’aide d’une lingette alcoolisée.
Percez le crâne des souris néonatales à l’aide de la pipette en verre tiré. Lorsque l’aiguille pénètre dans le crâne, appliquez une pression positive à travers l’aspirateur. Distribuez un microlitre du virus dans le ventricule latéral et retirez la pipette.
Placez la souris sur un coussin chauffant ou une chambre chauffante pour récupérer. Remettez l’animal dans la cage familiale une fois réveillé. Enregistrez des images de fluorescence traversant la section du cerveau à l’aide d’une lentille subjective 5x à faible grossissement.
En localisant le site d’injection, évaluer l’étendue de la transduction du virus, en fonction de la densité et de l’intensité des cellules fluorescentes rouges. Comparez les animaux qui ont été transduits de la même manière. Enregistrez des images fluorescentes avec un objectif de grossissement plus élevé de plus de 25x.
Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse et appliquez un filtre médian trois par trois pour réduire le bruit. Cliquez sur le menu Processus, puis cliquez sur Bruit, et choisissez l’option Despeckle. Ensuite, pour soustraire la fluorescence d’arrière-plan des images, commencez par séparer les canaux d’une image multicouche.
Cliquez sur le menu Image, puis sur Couleur, et sélectionnez l’option Diviser les canaux. À l’aide de l’outil de sélection de rectangle ou de cercle, dessinez une petite forme dans une zone de l’image sans cellules fluorescentes. Mesurez l’intensité moyenne en pixels de l’arrière-plan en cliquant sur Analyser, puis sur Mesurer, et répétez l’opération pour échantillonner plusieurs fois.
Faites la moyenne de la valeur moyenne des gris de cinq à huit zones d’arrière-plan et laissez tomber les valeurs décimales. Soustrayez les valeurs de chaque pixel de l’image en sélectionnant le menu Processus, puis cliquez sur Mathématiques et soustraire. Ensuite, entrez la valeur d’arrière-plan à soustraire, puis cliquez sur OK. Si nécessaire, fusionnez les canaux en une image multicanal en sélectionnant le menu Image, puis cliquez sur Couleur, puis sélectionnez Fusionner les canaux.
Pour compter le nombre de cellules fluorescentes vertes, masquez le canal vert et dessinez une forme autour de la région du cerveau exprimant la fluorescence rouge à l’aide de l’outil de sélection de forme libre. Cliquez sur la fonction Mesure pour mesurer la surface, la densité intégrée et la valeur de gris moyenne du canal rouge dans la zone sélectionnée. Comptez le nombre de cellules vertes à l’aide d’un outil de sélection multipoint et normalisez le nombre de cellules vertes par l’intensité intégrée du canal rouge.
Après avoir transduit le rapporteur amplificateur que la souris injectait par voie intracrânienne à P0 avec une construction AAV positive a montré une expression EGFP enhancer-driven dans les couches inférieures moyennes du cortex 28 jours après l’injection. La souris injectée avec une construction de contrôle négatif à P0 ne montre aucune expression de l’EGFP 28 jours après l’injection, démontrant que les éléments amplificateurs sont trouvés pour conduire la transcription de l’EGFP dans le cerveau de la souris. Pour visualiser la zone transduite avec succès et contrôler la variabilité potentielle, des bibliothèques de rapporteurs d’amplificateur AAV de différents titres ont été examinées.
La bibliothèque de titres élevés des amplificateurs candidats entraîne une large expression EGFP tandis que la bibliothèque de titres inférieurs des amplificateurs candidats entraîne une expression clairsemée de CGFP dans le cerveau de souris P7. Il est essentiel de mélanger le reporter amplificateur AAV avec le contrôle positif à chaque injection afin de faire la distinction entre les amplificateurs sans activité et les accouchements échoués. Cette procédure peut être associée à l’immunohistochimie, à l’ARN FISH ou au séquençage de l’ARN unicellulaire pour déterminer les types de cellules dans lesquels un amplificateur est actif.
