Ce protocole fournit une méthode alternative in vivo pour étudier le rôle de croissance tumorale d’un gène embryonnaire létal knockout. L’avantage de cette méthode est que des knockouts de gènes qui sont normalement létaux embryonnaires peuvent être effectués dans des tumeurs dérivées d’un modèle murin génétiquement modifié pour étudier leurs effets de perte de fonction in vivo. Cette technique peut être appliquée à des maladies qui nécessitent d’étudier le rôle in vivo de gènes essentiels embryonnaires inaccessibles à partir de modèles murins traditionnels de gènes knockout.
La génération du modèle animal prend du temps et des tests empiriques sont nécessaires pour déterminer la MOI optimale pour l’infection adénovirale afin de s’assurer qu’une recombinaison appropriée est réalisée. Pour commencer, identifiez la souris avec le génotype souhaité. Lorsqu’une souris porteuse de tumeur atteint son point d’extrémité humain, euthanasiez la souris et utilisez un couteau à scalpel stérile pour enlever la tumeur.
Disséquez la tumeur en trois sections dans des coupes de type pain à l’aide d’un couteau à scalpel pour générer les segments tissulaires pour la fixation du formol en intégrant la génération de culture de passage précoce et la congélation éclair pour les analyses analytiques. Tacher une section de tissu fixée au formol de cinq micromètres et incorporée à la paraffine avec de l’hématoxyline et de l’éosine. Une fois qu’un pathologiste confirme la tumeur, effectuez la coloration immunohistochimique pour confirmer le diagnostic de la tumeur.
Placez le tissu tumoral de la gaine nerveuse périphérique maligne fraîchement collecté dans 10 millilitres de PBS stérile glacé sur de la glace, puis transférez-le dans une zone de travail stérile pour établir des cultures de passage précoce. Hacher le tissu tumoral en morceaux de deux à quatre millimètres et triturer huit à 10 fois dans une boîte de culture tissulaire traitée de 10 centimètres carrés contenant 10 millilitres de milieu de croissance. Cultivez ces tissus dans un milieu de croissance DMEM-10 à haute teneur en glucose complété par 10 nanomolaires neuréguline-1 bêta et deux forskolines micromolaires.
Ensemencez les cellules tumorales à passage précoce à une densité de 1,5 fois 10 à la sixième cellule par boîte de culture tissulaire traitée de 10 centimètres carrés contenant un milieu de croissance DMEM-10. Après 12 à 16 heures, laver les cultures adhérentes avec deux à quatre millilitres de DPBS et infecter les cellules avec un adénovirus à environ 400 unités formant de la plaque par cellule dans 10 millilitres de DMEM sans sérum. Après 48 heures de l’infection, vérifiez brièvement les cellules pour le signal EGFP sur un microscope à fluorescence pour assurer une infection efficace avec environ 50 à 100% de cellules positives, puis FACS trier les cellules infectées EGFP-positives.
Après le tri FACS, laissez les cellules récupérer dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 24 à 48 heures, puis préparez les cellules pour des analyses cellulaires in vitro ou une greffe in vivo. Confirmer la délétion d’Erbb4 en effectuant une PCR à l’aide d’ADN génomique isolé d’une partie des cellules EGFP positives triées. Effectuer les tests de prolifération au cours des sept prochains jours sur des cellules tumorales triées plaquées dans une plaque de 96 puits à l’aide d’un cytomètre automatisé basé sur l’image.
Colorez les cellules avec des crochets et des colorants à l’iodure de propidium et capturez les images des cellules à l’aide d’un lecteur de plaques automatisé pour compter le nombre de cellules vivantes et mortes dans chaque puits. Isolez l’ARN total à partir de cellules tumorales triées en utilisant la méthode standard à base de guanidinium phénol et de chloroforme. Ouvrez le logiciel pour effectuer l’alignement de la séquence d’ARN en suivant les étapes spécifiques au programme à l’aide des paramètres par défaut.
Sélectionnez la méthode d’analyse, recherche d’ARN, puis sélectionnez le génome de référence de la souris. Téléchargez le fichier BED s’il en fournit un par le noyau de séquençage. Téléchargez les fichiers de séquençage FASTQ et attribuez des noms de réplication uniques aux fichiers.
Regroupez la réplication des fichiers FASTQ et désignez les fichiers dans un jeu de réplication. Pour l’analyse statistique et de normalisation afin d’identifier les signaux d’expression génique différentielle avec une puissance statistique robuste, ouvrez le logiciel d’analyse et sélectionnez les fichiers GFP FASTQ comme ensemble de données de contrôle. Ensuite, sélectionnez DESeq2 comme méthode statistique et de normalisation et démarrez l’assemblage et l’analyse.
Utilisez les ensembles de données d’ontologie génique intégrés dans les outils d’analyse de l’enrichissement fonctionnel en libre accès pour effectuer l’analyse de l’enrichissement fonctionnel sur le DEG identifié statistiquement significatif médié par Erbb4 afin de déterminer la signification biologique et la signification de la voie de la perte du gène Erbb4. Injecter les cellules tumorales dans le nerf sciatique de la souris anesthésiée pour évaluer le potentiel de croissance de l’allogreffe in vivo dans les cellules post-infectées. Une fois que la tumeur atteint la taille requise, disséquez la tumeur d’une souris euthanasiée en deux-trois sections comme démontré précédemment.
Fixez une section de tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit, puis incorporez la section fixe dans la paraffine. Après avoir fait des sections de cinq micromètres d’épaisseur à partir du tissu FFPE, montez la section sur les lames et confirmez la présence de cellules tumorales dans le tissu greffé en utilisant H & E et immunocoloration comme démontré précédemment. Pour confirmer in vivo les différences d’expression d’Erbb4 entre les deux conditions expérimentales, colorez le tissu fixé au formol et incorporé à la paraffine avec des anticorps spécifiques à Erbb4.
La transduction des cellules du tissu tumoral de la gaine nerveuse périphérique maligne avec l’adénovirus a été analysée. Les cellules exprimant l’EGFP ont été détectées à l’aide de la microscopie à fluorescence et le nombre total de cellules a été déterminé à l’aide de la microscopie à contraste de phase. Après l’ablation du gène à médiation Cre, en fonction de l’efficacité de la transfection, le génotypage par PCR a montré un knockout complet du gène et une population hétérogène de cellules induites et non induites par rapport à la transduction témoin.
L’histopathologie caractéristique trouvée dans les allogreffes orthotopiques des tissus tumoraux malins de la gaine nerveuse périphérique par rapport aux tumeurs dérivées des modèles animaux génétiquement modifiés originaux a démontré une différence dans la morphologie cellulaire. L’ablation d’Erbb4 a diminué la densité cellulaire et la prolifération cellulaire dans les cellules adéno5-CMV-créblées contrôlent les cellules transduites adéno5-CMV-GFP. L’expression d’Erbb4 dans les cellules tumorales transduites avec l’adéno5-CMV-Cre, ou virus EGFP, a diminué dans le résultat des allogreffes transduites adéno5-CMV-Cre par rapport aux tumeurs allogreffes traitées par adéno-CMV-EGFP de contrôle.
La densité vasculaire a été évaluée par détection d’immunoréactivité pour CD31, et les résultats représentatifs ont montré une densité vasculaire nettement réduite dans les allogreffes de cellules transduites adéno5-CMV-Cre par rapport aux cellules adéno5-CMV-EGFP-transduites témoins. Après l’ablation génique, les cellules peuvent être utilisées pour de nombreux types de tests cellulaires tels que la prolifération, la migration, la croissance 3D ou les altérations du microenvironnement, ainsi que pour des injections orthotopiques in vivo.
