Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck.

Une. Création de plasmides <ol><li> Sous-cloner les ADNc pour chacune des protéines d&#39;intérêt dans les deux vecteurs Pluc et pYFP, ​​en utilisant des techniques standards de biologie moléculaire (figure 1). Pour les protocoles détaillés voir Green et al 13. </li><li> Toutes les constructions de séquence pour vérifier que les protéines d&#39;intérêt sont en phase avec la séquence Luc / YFP, sans codons d&#39;arrêt intermédiaires. </li><li> Effectuer des essais fonctionnels comme souhaité afin de confirmer que les protéines de fusion conservent une activité biologique. Dans le cas présenté ici, la localisation subcellulaire des protéines de fusion YFP a été déterminée par microscopie à fluorescence. </li><li> Faire des plasmides d&#39;expression pour les protéines de contrôle Luc et YFP appropriées par l&#39;ingénierie des signaux de ciblage appropriées dans les vecteurs d&#39;expression et Pluc pYFP. Dans le cas présenté ici, générer des constructions Luc et YFP nucléaires ciblées par l&#39;insertion d&#39;un signal de localisation nucléaire dans les vecteurs pLuc et pYFP. </li><li> Faireune construction de contrôle positif dans lequel Luc et YFP sont fusionnés en un seul polypeptide. Dans le cas présenté ici, de générer un témoin positif dans lequel la séquence codante de la YFP est inséré dans le vecteur pLuc. </li><li> Sélectionner un plasmide de remplissage neutre à utiliser pour égaliser la masse d&#39;ADN dans les mélanges de transfection. Utilisation d&#39;un plasmide qui n&#39;a pas de promoteur eucaryote et sera donc transcriptionnellement inactif dans les cellules de mammifères, par exemple un vecteur de clonage bactérien. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;ADN Mixes <ol><li> Estimer la concentration de tous les plasmides décrits dans la section 1 sur la base de l&#39;absorbance à 260 nm (1 unité d&#39;absorbance est équivalente à 50 pg / ml d&#39;ADN). Déterminer la masse moléculaire de chaque plasmide en multipliant le nombre de paires de bases par 650 Da. Utilisation de la concentration et de la masse moléculaire pour calculer la concentration molaire de chaque préparation de plasmide. Diluer les préparations d&#39;ADN de plasmide à une concentration de 36 nM. Ce seront les stocks de roulementqui seront utilisés pour préparer les mélanges d&#39;ADN pour la transfection. </li><li> Préparer un mélange d&#39;ADN de contrôle contenant 1800 ng de plasmide de remplissage dans un volume final de 20 ul d&#39;eau. </li><li> Préparer un mélange d&#39;ADN témoin contenant 5 ul du produit d&#39;assemblage pLuc-contrôle. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l&#39;ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l&#39;eau pour amener le volume final à 20 pi. </li><li> Préparer un mélange d&#39;ADN de contrôle contenant 5 pi de pLuc contrôle construction et 5 pi de pYFP contrôle construction. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l&#39;ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l&#39;eau pour amener le volume final à 20 pi. </li><li> Préparer un mélange d&#39;ADN témoin contenant 5 ul de construction témoin positif. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l&#39;ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l&#39;eau pour amener le volume final à 20 pi. </li><li> Préparez le mélange ADN suivante pour tester homodimérisation d&#39;une protéine d&#39;intérêt, X. Pour chaque mélange d&#39;ADN combiner 5 pi de la pLuc pertinent construire et 5 pi de la pYFP construire. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l&#39;ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l&#39;eau pour amener le volume final à 20 pi. A) pLuc-contrôle et pYFP-X B) pLuc-X et pYFP-contrôle C) pLuc-X et pYFP-X </li><li> Préparer le mélange d&#39;ADN suivant pour tester une interaction entre une paire de protéines d&#39;intérêt, X et Y. Pour chaque mélange d&#39;ADN combinent 5 ul de la pLuc pertinent construire et 5 ul de la pYFP construisent. Ajouter charge plasmide pour amener la masse de l&#39;ADN total de 1 800 ng. Ajouter de l&#39;eau pour amener le volume final à 20 pi. A) pLuc-contrôle et pYFP-X B) pLuc-X et pYFP-contrôle C) pLuc-contrôle et pYFP-Y D) pLuc-Y et pYFP-contrôle E) pLuc-X et Y-pYFP F) pLuc-Y et X-pYFP </li></ol> 3. Transfection <ol><li> Récolte subconfluentes cellules HEK293 à partir d&#39;un flacon de 75 cm 2. Diluer à 10% des cellules totales dans 13 ml de milieu de culture. Distribuer 130 l de suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une blancheclair à fond plaque de 96 puits de culture de tissu. Culture des cellules pendant 24 heures. </li><li> Calculer le nombre de puits à transfecter en multipliant le nombre de mélanges d&#39;ADN en 3. Porter le milieu de culture exempt de sérum à température ambiante. Préparer un mélange maître contenant 6,3 ul de milieu sans sérum et 0,18 ul réactif de transfection par puits. Mélanger au vortex et incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Préparez des mélanges de transfection en ajoutant 2 ul d&#39;ADN mélange à 20 pi de milieu / réactif de transfection master mix sans sérum. Ne pas vortex. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Transfecter trois puits avec chaque mélange de transfection de distribution de 6,5 pi de mélange de transfection par puits. Culture des cellules pour un autre 36-48 h. </li></ol> 4. Mesure de BRET Signal <ol><li> Dissoudre le substrat de la luciférase des cellules vivantes à 34 mg / ml dans le DMSO par vortex. </li><li> Diluer substrat de la luciférase des cellules vivantes reconstitué à 1:1000 dans le substrat dilution moyen pre-chauffé à 37 ° C. Laisser 50 ul de milieu de dilution du substrat par puits. Vortex à mélanger. Un précipité peut se former, mais ne va pas interférer avec le dosage. </li><li> Aspirer le milieu de culture à partir de la plaque à 96 puits. Distribuer 50 ul de substrat de la luciférase des cellules vivantes dilué dans chaque puits. Culture de cellules pendant au moins 2 h (jusqu&#39;à 24 h). </li><li> Enlever le couvercle de la plaque à 96 puits et incuber la plaque pendant 10 min à température ambiante à l&#39;intérieur du luminomètre. </li><li> Mesurer les émissions de Luc et YFP un bien à la fois. Mesurer les émissions de Luc en utilisant un filtre de blocage des longueurs d&#39;onde de 470 nm. Mesurer l&#39;émission à partir de la YFP en utilisant un filtre passe-bande de 500 à 600 nm. Intégrer des signaux d&#39;émission de plus de 10 sec. </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> La moyenne des lectures d&#39;émission Luc des 3 puits n&#39;ayant reçu que le plasmide de remplissage. Soustraire cette valeur de toutes les autres lectures d&#39;émission Luc à produire des valeurs d&#39;émission Luc fond soustrait.</li><li> La moyenne des lectures d&#39;émission YFP des 3 puits n&#39;ayant reçu que le plasmide de remplissage. Soustraire cette valeur de toutes les autres lectures d&#39;émission YFP pour produire des valeurs d&#39;émission YFP fond soustrait. </li><li> Pour chaque puits, il faut diviser la valeur d&#39;émission YFP fond soustrait de la valeur d&#39;émission Luc fond soustrait pour donner le rapport de BRET non corrigée. </li><li> La moyenne des ratios de BRET non corrigées des trois puits qui ont été transfectées avec seulement le plasmide pLuc-contrôle. Soustraire cette valeur à partir de tous les autres rapports de BRET non corrigées pour donner les rapports de BRET corrigé. </li><li> Pour chacun des ensembles restants de rapports de BRET corrigé, la moyenne des valeurs des trois puits transfectés pour obtenir un rapport final BRET. </li></ol>

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li><li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening.">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li><li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La conception des produits d&#39;assemblage d&#39;expression de protéines de fusion est une étape critique dans la mise en place de l&#39;essai de BRET. Dans les expériences présentées ici, les protéines d&#39;intérêt ont été fusionnées à l&#39;extrémité C-terminale de la luciférase ou de la YFP. Il est également possible, et peut être nécessaire, pour faire fondre les protéines à l&#39;extrémité N-terminale de la luciférase / YFP. Pour certaines protéines, les fusions ne peuvent être acceptées...

Tant liaison classique et nouvelle génération analyses séquençage de troubles humains sont révélateurs de la pertinence clinique de protéines impliquées dans une gamme de voies biologiques. Il est souvent le cas que, préalablement à leur identification dans de telles études, on a observé peu ou pas d&#39;investigation du rôle biologique de ces protéines. Une piste intéressante pour commencer à explorer la fonction biologique d&#39;une protéine d&#39;intérêt est d&#39;identifier d&#39;autres protéines interagit avec dans son contexte physiologique. Caractérisant les réseaux moléculaires de cette façon permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents du phénotype humain. Le dépistage à grande échelle le plus fréquemment utilisé des approches pour identifier les partenaires d&#39;interaction de candidats pour des protéines d&#39;intérêt sont la levure dépistage double-hybride 1 et protéomique basée sur la spectrométrie de masse 2. Ces méthodes peuvent être très réussie en proposant des protéines interagissant potentiels, mais are vulnérables à des résultats faussement positifs. Par conséquent, la confirmation d&#39;une interaction identifié par deux hybrides de levure ou de dépistage de la spectrométrie de masse nécessite l&#39;interaction de validation en utilisant une seconde technique. Généralement, une co-immunoprécipitation ou dosage déroulant est utilisé à cet effet 3. Un inconvénient de l&#39;utilisation de telles techniques de validation est la condition pour la lyse des cellules, ce qui détruit les conditions intracellulaires qui peuvent être essentielles pour le maintien de certaines interactions protéiques. Un deuxième inconvénient est que les interactions entre protéines faibles ou transitoires peuvent être perturbées lors des étapes de lavage. En outre, ces dosages demandent significatives le temps de manipulation, sont limités dans le nombre d&#39;échantillons qui peuvent être traités en même temps, et nécessitent souvent l&#39;optimisation des temps de réactifs et de protocoles. Pour surmonter certains des problèmes associés à des expériences de co-immunoprécipitation, plusieurs dosages ont été développés sur la base de fluorescence et bioluminescent protéines qui peuvent être utilisées dans des cellules vivantes. Les premiers essais ont été basés sur la fluorescence (ou Förster) de transfert d&#39;énergie par résonance (FRET), le transfert non radiatif de l&#39;énergie entre deux protéines fluorescentes avec chevauchement spectres d&#39;émission et d&#39;excitation 4. L&#39;efficacité du transfert d&#39;énergie est fortement dépendant de la distance, par conséquent, l&#39;observation du phénomène de FRET nécessite que les fluorophores donneurs et accepteurs d&#39;être en étroite proximité. Pour tester une interaction entre deux protéines d&#39;intérêt, une protéine est exprimée comme une fusion avec le fluorophore donneur (protéine fluorescente communément cyan; PCP) et le second en tant que fusion avec le fluorophore accepteur (protéine fluorescente communément jaune; YFP). Une interaction entre les deux protéines d&#39;intérêt peut apporter les fluorophores donneur et accepteur suffisamment proches pour le transfert de l&#39;énergie de se produire, ce qui se traduira par une augmentation mesurable de l&#39;émission de lumière de l&#39;accepteur YFP par rapport au donneur PCP. FRET a été couronnée de succès dans la détection des interactions protéine-protéine dans des cellules vivantes 4. Le principal inconvénient de l&#39;utilisation de FRET pour la détection des interactions protéine-protéine est la condition pour l&#39;éclairage extérieur pour l&#39;excitation du fluorophore donneur. Les résultats de l&#39;éclairage extérieur à haute fond dans le signal d&#39;émission, non désirée excitation de l&#39;accepteur, et photoblanchiment des fluorophores donneur et accepteur. Ces effets réduisent la sensibilité du dosage pour la détection des interactions protéine-protéine. Une modification de l&#39;essai de FRET qui résout le problème de fond élevé de l&#39;éclairage extérieur est le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence (BRET) dosage 5,6. Dans le système de BRET du fluorophore donneur est remplacée par une enzyme luciférase. Ainsi, l&#39;énergie pour l&#39;excitation du fluorophore accepteur est générée au sein du système par l&#39;oxydation d&#39;un substrat de la luciférase, ce qui rend inutile l&#39;éclairage extérieur. Dans la plupartla configuration courante de ce test, le donneur est luciférase de Renilla reniformis et l&#39;accepteur est la YFP (pour une discussion sur les protéines donneur alternatif et accepteurs voir Pfleger et al. 5). En conséquence, dans ce système, une protéine d&#39;intérêt est fusionnée à la luciférase et une protéine interagissant potentiellement à YFP, ou vice versa. L&#39;essai BRET nécessite l&#39;addition de coelentérazine en tant que substrat pour la luciférase. Parce que la coelentérazine est perméable aux cellules, il est possible d&#39;effectuer des dosages de BRET dans les cellules vivantes. Cependant, la coelentérazine native est instable en solution aqueuse, et la décomposition d&#39;enzyme indépendant de la coelentérazine la fois de réduire la concentration de substrat disponible pour le test et génère autoluminescence, ce qui réduit la sensibilité des mesures de l&#39;activité de la luciférase. L&#39;utilisation de BRET dans les cellules vivantes a été facilitée par le développement de cœlentérazines protégées, qui sont stables en solution aqueuse mais sont clivés par estérase cytosoliques après diffusion à travers la membrane de la cellule pour générer coelentérazine actif à l&#39;intérieur de la cellule 7. Après l&#39;addition du substrat à des cellules exprimant la luciférase et la YFP protéines de fusion, le transfert d&#39;énergie résultant d&#39;interactions protéine-protéine est quantifiée en contrôlant l&#39;émission de la luciférase et la YFP. Parce que les interactions protéine peuvent être contrôlées directement dans les cellules vivantes dans des plaques multi-puits, l&#39;essai BRET constitue une méthode simple et évolutive pour valider les interactions putatifs qui est le coût en temps et en efficacité. En plus de valider interacteurs putatifs identifiés dans les études de dépistage de la protéomique, le système BRET peut également être utilisé pour interacteurs candidats de test découlant des études biochimiques et structurales antérieures sur la protéine d&#39;intérêt. Une fois que l&#39;existence d&#39;une interaction protéine-protéine a été établie (soit en utilisant l&#39;essai de BRET ou par d&#39;autres techniques), il existe un potentiel pour l&#39;essai de BRET pour être empLoyed en outre de caractériser l&#39;interaction. Par exemple, les régions qui interagissent peuvent être mappés en générant des versions tronquées des protéines, et l&#39;implication de résidus spécifiques de l&#39;interaction peuvent être démontrés en créant des mutations ponctuelles. En outre, l&#39;effet modulateur de modifications post-traductionnelles ou de petites molécules (telles que des médicaments ou des ligands) sur les interactions protéine-protéine peut être étudiée 8-10. L&#39;essai BRET a aussi un grand potentiel pour l&#39;étude des mutations identifiées dans l&#39;ADN du patient. Dans les cas où un rôle causal pour une mutation a été établie, l&#39;étude de l&#39;effet de la mutation sur les interactions protéine-protéine à l&#39;aide de BRET peut révéler plus sur l&#39;étiologie moléculaire du phénotype 11. Depuis l&#39;avènement de méthodes de séquençage de prochaine génération, il est de plus en plus commun pour plusieurs mutations potentiellement nuisibles à être identifiés dans un individu, dans ce cas, on ne sait pas qui sont pertiVant au phénotype 12. Dans cette situation, l&#39;essai BRET peut être utile dans l&#39;évaluation de l&#39;impact des mutations sur la fonction des protéines et donc leur pertinence à la maladie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Essais basés sur le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence (BRET) fournissent un moyen sensibles et fiables pour surveiller les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. BRET est le transfert non radiatif de l&#39;énergie à partir d&#39;un &quot;donneur&quot; à une enzyme luciférase &quot;accepteur&quot; protéine fluorescente. Dans la configuration la plus courante de ce dosage, le donneur est la luciférase de Renilla et l&#39;accepteur est une protéine fluorescente jaune (YFP). Parce que l&#39;efficacité du transfert d&#39;énergie est fortement dépendant de la distance, de l&#39;observation du phénomène BRET exige que le donneur et l&#39;accepteur se trouver à proximité. Pour tester une interaction entre deux protéines d&#39;intérêt dans des cellules de mammifères en culture, une protéine est exprimée comme une fusion avec la luciférase et la seconde comme une fusion avec YFP. Une interaction entre les deux protéines d&#39;intérêt peut apporter le donneur et accepteur suffisamment proche pour le transfert de l&#39;énergie de se produire. Par rapport à d&#39;autres techniques d&#39;investigation protéine-protéine dansinteractions, l&#39;essai BRET est sensible, nécessite peu de mains sur le temps et quelques réactifs, et est capable de détecter les interactions qui sont faibles et transitoires, ou dépendant de l&#39;environnement biochimique trouvé dans une cellule vivante. Il s&#39;agit donc d&#39;une approche idéale pour confirmer les interactions putatives ont été proposées par les deux hybrides de levure ou des études de protéomique par spectrométrie de masse, et en outre, il est bien adaptée pour les régions de cartographie interagissant, l&#39;évaluation de l&#39;effet de modifications post-traductionnelles sur les interactions protéine-protéine, et évaluer l&#39;impact des mutations identifiées dans l&#39;ADN du patient.

Le principe de l&#39;essai de BRET est illustré sur la figure 2. L&#39;installation de dosage utilisée dans les expériences présentées ici est représenté sur la figure 3. La détection d&#39;un signal de BRET solide à partir de cellules transfectées avec une protéine de fusion luciférase-YFP a confirmé que le transfert d&#39;énergie était observable dans ce dispositif expérimental (figure 4). Notre recherche se concentre sur l...

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Les interactions entre protéines sont essentielles à tous les processus cellulaires. Utilisation Bioluminescence Resonance Energy Transfer, l&#39;interaction entre une paire de protéines peut être surveillée dans des cellules vivantes et en temps réel. En outre, les effets des mutations potentiellement pathogènes peuvent être évaluées.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.8K vues.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  Les interactions entre protéines sont essentielles à tous les processus cellulaires. Utilisation Bioluminescence Resonance Energy Transfer, l'interaction entre une paire de protéines peut être surveillée dans des cellules vivantes et en temps réel. En outre, les effets des mutations potentiellement pathogènes peuvent être évaluées. 

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Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Recherche

Biologie

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identifier les sites d&#39;interaction protéine-protéine à l&#39;aide de peptides tableaux

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...