L’agent trypanosoma cruzi de la maladie de Chagas peut produire des infections symptomatiques durables qui peuvent s’ouvrir dans la pathologie médicalement reconnue. La découverte des nids trypanosoma cruzi dans le tube séminifère d’un garçon mort de la maladie de Chagas suggère le protocole de recherche pour démêler la transmission sexuelle possible des parasites Chagas. Fournir des soins de santé pour une période de cinq ans et recruter les familles, montrant aux participants présentant des symptômes cliniques de la maladie aiguë de Chagas, ACG.
Obtenu 15 ml de sang veineux des participants de la famille à trois reprises à un an d’intervalle, divisé en trois, cinq mil aliquots et stocker à quatre Centigrades. Recueilli deux ml de l’éjaculat sérique de volontaires adultes montrent le T.cruzi dans le sang des cas d’ACG pour valider les analyses moléculaires. Isoler le T.cruzi de l’aliquot de sang ACG est stocké dans stérile tube de 10 ml avec anticoagulant.
Inoculer cinq ml de sang en 50 ml d’inclinaisons de tube plus cinq ml de tryptose moyenne d’infusion de foie et incuber dans un shaker à 27 Centigrades pendant trois mois. Recherchez la microscopie pour le T.cruzi dans 100 microlitres du supernatant sur la glissière de verre. Récolter les flagellates du centrifugé moyen à 1000 x G pendant 10 min et les laver au pH PBS 7,4.
Inoculer 75 ml de flacon de culture cellulaire musculaire L6 chacun avec 10 à la sixième T.cruzi isole. Nourrir les cellules de culture avec 15 ml de Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM à 37 Centigrades. Cultiver les isolats parasites et le contrôle positif Bérénice T.cruzi.
Cultivez le T.cruzi relative Leishmania braziliensis dans DMEM comme un contrôle négatif. Utilisez 10 x 10 à la sixième culture tissulaire dérivée de T.cruzi trypomastigotes pour infecter les souris. Recherchez les nids des T.cruzi dans les sections des muscles et des organes de reproduction après un mois.
Utilisez les aliquots sanguins dans le tube stérile de 10 ml d’EDTA Corning et recueillez les globules blancs par centrifugation de gradient de densité à 3000 x G pendant 45 min. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et de la centrifugeuse à 1500 x G pendant 10 min à un tube différent. Extraire l’ADN de l’isolat envoyé de la Bérénice T.cruzi de L.braziliensis de 109 sujets familiaux et du spermatozoa de 21 participants comme dans l’étape 3.3 du protocole.
Mesurer les concentrations d’ADN sur le gel agarose de 0,8 % et les absorber à 206 nanomètres. Utilisez le T.cruzi TCZ un tiret deux amorces anneal à la sonde nucléotide 188 dans l’analyse PCR. Faire le mélange PCR avec 10 nanogrammes d’ADN modèle, 0,4 micromolaire de chaque paire d’amorces, deux unités stockent polymésase d’ADN, 0,2 micromolaire ADN-TPs, et 5 chlorure de magnésium micromolaire dans un volume final de 25 microlitres.
Procéder à l’amplification de l’ADN comme à l’étape 3.5.2 et montrer les bandes d’ADN dans le gel. Utilisez l’étiquette de sonde nucléotide T.cruzi 188 à ce jour avec alpha 32P dATP et séparez le produit PCR sur un gel d’agarose de 1,3 % et transférez-le sur une membrane de nylon chargée positivement. Lavez la membrane et exposez-la maintenant au champ de rayons X pendant des périodes variables.
Cultivez les clones sélectionnés dans le champ de rayons X et séquencez commercialement avec le TCZ un tiret deux amorce. Effectuer trois analyses indépendantes d’immunofluorescence et tripler une à 100 dilution sérique dans PBS de 109 participants à l’étude. Centrifugeuse les cinq ml aliquot du sang enfermé à 1000 x G pendant 30 min et stocker le sérum à moins 20 Centigrades.
Exécuter des dilutions sériques indépendantes d’immunofluorescence à partir des échantillons de l’étude obtenus à trois reprises à un an d’intervalle. Utilisez 5 microlitres des amastigotes T.cruzi formellement incubés ou promastigotes L.braziliensis, 10 parasites par microlitre dans les suspensions PBS sur la glissière de verre et laissez sécher pendant la nuit, comme à l’étape 5.3.3. Incuber le parasite sur le verre avec 100 microlitres de l’un à 100 dilutions sériques et couvrir de glissement dans une chambre humide pendant une heure à 37 Centigrades, puis laver deux fois avec PBS.
Incubez les glissières de verre séchées à l’air avec une à 1000 dilution d’un anticorps de lapin étiqueté fluorescéine à l’IgG humain, lavez et séchez aussi. Montez la glissière de verre avec un glissement de couverture et examinez-la sous le microscope à lumière UV. Détecter le T.cruzi et l’antigène soluble L.braziliensis un microgramme dans 100 microlitres de carbonate tampon pH 9,6.
Incuber avec 100 microlitres de la dilution de sérum de un à 100 dans les puits en quart de triplicate. Lavez les assiettes deux fois avec des solutions PBS-Tween et attendez de sécher. Incuber avec 100 microlitres de l’un à 1000 dilutions de phosphatase alcaline conjuguée, chèvre anti-lapin IgG.
Laver les assiettes deux fois avec PBS-Tween, ajouter le substrat para-nitrophenylphospate et attendre le développement de la couleur. Lisez les densités optiques à 630 nanomètres dans un lecteur de plaques multi-mode. Transilluminer les œufs de poulet fertiles et faire un trou dans la coquille à leur bulle.
Inoculer 100 trypomastigotes sur chaque milieu de culture de coquille dans les oeufs de contrôle simulés. Sceller le trou avec du ruban adhésif. Incuber les œufs à 37 Centigrades, 65% d’humidité pendant 21 jours.
Faire pousser les poussins éclos à partir d’œufs témoins vivants groupe A à partir des contrôles simulés, le groupe B et des oeufs inoculés T.cruzi, groupe C jusqu’à leur vie adulte. Défiez les poulets du groupe B et C deux fois avec 10 x 10 à la septième trypomastigote formellement incubée chaque semaine. Obtenez deux ml de sang veineux d’une veine d’aile des poulets A, B et C cinq semaines après le défi.
Séparez le sérum et exécutez l’analyseur d’immunofluorescence pour détecter l’anticorps de T.cruzi. Assurer le bien-être des animaux grâce à un excellent logement, de la nourriture et de l’approvisionnement en eau. Utilisez l’éjaculat de sperme d’un adulte, et un cas positif de maladie de Chagas d’APCR, et d’un sujet de contrôle comme dans l’étape 1.5 du protocole.
Instiller 100 microlitres aliquots de sperme dans le péritonéal et dans le vagin des souris. La transmission sexuelle de l’infection à T.cruzi chez les souris parentales et de descendance. L’empreinte du Trypanosoma cruzi de la maladie aiguë de Chagas a montré par les produits nDNA-PCR qui se forment à l’avance avec la sonde étiquetée radio.
Le phénotype du T.cruzi s’est révélé avec l’essai d’immunofluorescence. L’anti-T. l’anticorps cruzi ne reconnaît pas L.braziliensis.
Représentation graphique de l’ELISA et des analyses nDNA-PCR. Groupes un et deux respectivement, contrôle négatif et positif. Groupe trois, nDNA-PCR positif et les analyses spécifiques d’anticorps.
Groupe quatre avec les infections t.cruzi détectées par le nDNA-PCR mais en l’absence de l’anticorps spécifique. Groupe 5, participants sans infection. Les herogrammes et la cartographie de la population familiale ont montré des écarts entre les ratios de l’anti-T.
l’anticorps cruzi et ceux des analyses nDNA-PCR. Ouvert est carré et le cercle, négatif mâle et femelle. Rouge avec anti-T.
cruzi anticorps et nDNA-PCR positif. Noir, positif nDNA-PCR seul. La tolérance immunitaire chez les poulets éclos à partir d’œufs inoculés T.cruzi.
A, simulacre de contrôle, B, poulets contrôlés vivants mis au défi avec l’antigène T.cruzi. C, les poulets éclos à partir des oeufs inoculés T.cruzi après défi avec l’antigène spécifique. L’infectiosité du T.cruzi a montré sur le sperme instille dans la cavité péritonéale et dans le vagin.
Les souris sacrifiées trois semaines de ces alésages ont montré le nid d’amastigote dans le coeur, dans le muscle squelettique, et dans les déférents de vas et dans le tube utérin. La transmission sexuelle des infections t.cruzi dans le système de modèle de souris. Les mâles et les femelles infectés par T.cruzi ont transmis l’infection à des compagnons naïfs.
L’infection à T.cruzi a été transférée verticalement des souris parentales aux souris progéniture. Le ballonnement du Sud a révélé la bande d’anginate parasite dans la majorité des portées de F1. La tache d’immunoperoxidase T.cruzi amastigotes a montré l’engoniablast et dans l’interstitiel de l’épididyme et dans le lumen des tubes séminifères des souris progénitrices.
La démonstration parasitologique du protozoaire dans 21 cas aigus de la maladie de Chagas était cruciale pour valider l’empreinte de T.cruzi dans tous les sujets infectés. Les écarts entre les rapports des analyses d’anticorps parasites et ceux des essais d’acides nucléiques ont indiqué la majorité des empreintes dans les patients anticorps-libres. La grande différence explique bien dans le modèle de poulet réfléchie à la T.cruzi après la première semaine du développement de l’embryon.
La tolérance immunitaire des poulets adultes a montré les empreintes parasites, mais avec l’absence de l’anticorps spécifique. L’anti-cruzi vital dans les éjaculats patients de Chagas a lancé des infections répandues sur instille dans le vagin de souris et aussi bien dans la cavité péritonéale. La pathologie a montré les nids d’amastigote de T.cruzi dans le coeur et les muscles squelettiques et dans les déférents de vas et le tube utérin.
L’élevage de souris Chagas avec des compagnons naïfs a révélé que les femelles et les mâles infectés transmettaient le T.cruzi aux compagnons naïfs non infectés et que la majorité de leurs portées avaient acquis l’infection transférée verticalement à la progéniture. Le protocole familial a abordé l’analyse des acides nucléiques afin d’effectuer des transfusions sanguines fiables et des enquêtes épidémiologiques et d’élucider la maladie potentielle de Chagas sexuellement transmissible.
