Notre protocole décrit la conception, l’assemblage et la validation de diagnostics basés sur des circuits génétiques. Ces diagnostics moléculaires sur papier sont peu coûteux et sensibles, capables de détecter des concentrations cliniquement pertinentes d’acides nucléiques et peuvent être conçus pour détecter pratiquement n’importe quelle séquence. Il s’agit d’une technologie de plate-forme qui peut être conçue par les utilisateurs pour leurs besoins et qui a le potentiel d’apporter des diagnostics de qualité clinique dans des contextes de ressources dentaires plus décentralisés.
Le capteur de commutation sans cellule peut être conçu pour pratiquement toutes les cibles à base d’acides nucléiques. Des travaux récents ont démontré des diagnostics acellulaires pour Ebola, les norovirus, le SRAS-CoV-2, C. difficile et les bactéries causant la typhoïde. Severino Jefferson Rivero da Silva, boursier postdoctoral, et Pouriya Bayat, doctorant de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour concevoir l’interrupteur de maintien du pied, identifiez les séquences cibles du génome du virus Zika et choisissez les séquences cibles du virus Zika parmi les amplicons comme décrit dans le protocole texte. Téléchargez le progiciel de conception de l’interrupteur de maintien du pied. Ouvrez MATLAB et accédez au dossier du logiciel de conception.
Entrez les séquences cibles dans le fichier csv du fichier d’entrée de conception situé dans le sous-dossier d’entrée. Sélectionnez les paramètres à utiliser pour la fonction de conception. Exécutez la fonction de conception pour générer les conceptions d’interrupteur de maintien pour les cibles d’intérêt.
Une fois terminé, accédez au dossier final_designs et localisez les séquences de conception du commutateur d’arrêt supérieur et les séquences cibles correspondantes dans des feuilles de calcul au format csv. Assurez-vous que les séquences d’ADN de l’interrupteur de maintien générées par l’algorithme contiennent les séquences promotrices T7 à l’extrémité principale cinq et une séquence de liaison nucléotidique 21 conservée à l’extrémité des trois premières. Utilisez NCBI BLAST pour analyser les séquences de conception de l’interrupteur de maintien du pied supérieur contre d’autres virus courants en vérifiant l’homologie des séquences.
Acceptez les séquences avec moins de 40% d’hémologie. Préparer des solutions d’oligos d’ADN en épingle à cheveux et d’amorces d’amplification inverse à une concentration de 10 micromolaires dans de l’eau exempte de nucléase. Assembler les réactions dans des tubes de PCR sur glace selon ce tableau.
Placez les tubes de réaction dans un thermocycleur, en suivant les conditions de cyclage indiquées dans ce tableau. Analysez les produits PCR sur un gel d’agarose. Purifier les produits de PCR et éluer l’ADN dans un volume minimal d’eau exempte de nucléases pour assurer une concentration suffisamment élevée.
Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Préparer une solution mère CPRG en dissolvant 25 milligrammes de poudre dans un millilitre d’eau sans nucléase. Préparez un mélange principal sur glace selon le protocole standard illustré ici.
Distribuer le mélange-maître sans cellules dans des tubes PCR. Pour les commandes sans cellules et les commandes de commutation seules, ajoutez de l’eau sans nucléase à un volume de 5,94 microlitres. Et pour la réaction, ajoutez de l’ADN de commutateur de maintien purifié par PCR pour obtenir une concentration finale de 33 nanomolaires.
Pour tester l’interrupteur de maintien et la combinaison d’ARN cible, ajoutez in vitro de l’ARN cible transcrit à une concentration finale d’une micromolaire. Bien mélanger toutes les réactions en pipetant et en centrifugeant brièvement. Sur une plaque noire à fond clair de 384 puits, ajoutez 30 microlitres d’eau exempte de nucléases aux puits entourant les puits de réaction.
Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie de deux millimètres et d’une pince à épiler, coupez les disques de papier filtre bloqués par BSA et placez-les dans les puits de réaction. Distribuer 1,8 microlitre de chaque tube de réaction sur les disques de papier filtre dans la plaque de 384 puits en trois exemplaires. Couvrez la plaque avec un film PCR transparent et placez-la dans un lecteur de plaques.
Mesurez l’absorbance à 570 nanomètres à 37 degrés Celsius toutes les minutes pendant 130 minutes. Préparer une solution mère de 25 micromolaires de tous les ensembles d’amorces avant et arrière dans de l’eau sans nucléase. Configurez une réaction de cinq microlitres à l’aide du mélange principal illustré ici.
Mélanger par pipetage jusqu’à ce que le précipité blanc se solubilise, puis distribuer dans des tubes de PCR. Ajouter les amorces avant et arrière aux tubes appropriés, puis ajouter un microlitre d’eau sans nucléase ou deux images d’ARN déclencheur cible. Mélanger par pipetage doux et faire tourner brièvement les tubes.
Configurez le protocole d’incubation sur un thermocycleur comme illustré ici. Après 12 minutes, retirez les tubes et ajoutez 1,25 microlitre du mélange d’enzymes dans chaque tube, puis mélangez et centrifugez. Remettez les tubes dans le thermocycleur après avoir sauté l’étape de maintien de 41 degrés Celsius pour commencer l’incubation de réaction d’une heure.
Ensuite, pour évaluer les performances de l’amorce, assemblez les réactions de l’interrupteur sans pile à base de papier et analysez les données. Pour l’analyse de sensibilité, identifier les paires d’amorces candidates et préparer des dilutions en série de l’ARN cible dans de l’eau exempte de nucléase. Répétez la NASBA et les réactions acellulaires avec les ensembles d’amorces sélectionnés en triplicates biologiques.
À l’aide d’un microlitre d’ARN de patient extrait, effectuez l’amplification NASBA et les réactions sans cellules à base de papier, comme indiqué à la section cinq. Après les réactions, préparer la plaque de réaction à 384 puits et exécuter le test dans un lecteur de plaque portable à 37 degrés Celsius. Assemblez ensuite les composants RT-qPCR et ajoutez les réactifs dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre selon ce tableau.
Mélanger la réaction par pipetage. Distribuer 6,5 microlitres dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits ou 384 puits, suivis de 3,5 microlitres de chaque matrice d’ARN en trois exemplaires. Placez un film PCR sur le dessus de la plaque.
Centrifuger la plaque de 384 puits à 600 fois G pendant deux minutes. Placez la plaque dans une machine RT-qPCR et exécutez les conditions de cyclage comme indiqué ici. Après la conception informatique, trois interrupteurs de maintien ont été construits et analysés à l’aide d’électrophorèse sur gel d’agarose.
Une bande d’environ 3 000 paires de bases indiquait une réaction réussie. Les interrupteurs de maintien ont été évalués par rapport à leur ARN déclencheur transcrit in vitro respectif. Alors que les trois capteurs affichaient une augmentation de l’absorbance, le capteur 27B avait le taux de démarrage le plus rapide, tandis que les commutateurs 33B et 47B avaient un rapport marche/arrêt plus faible, indiquant une activité de fond et une spécificité réduite.
Le changement de pli de l’absorbance à 570 nanomètres a montré que l’interrupteur 27B a les meilleures performances avec un rapport de signal marche/arrêt. De plus, lorsqu’il est couplé à la NASBA, il peut détecter l’ARN à des concentrations aussi faibles que 124 molécules par microlitre, ce qui indique une sensibilité élevée. Des échantillons de patients atteints du virus Zika du Brésil ont été testés pour évaluer la précision diagnostique clinique des capteurs à l’aide d’un lecteur de plaque portable.
Un changement de couleur du jaune au violet a permis d’identifier un échantillon positif. La réponse colorimétrique pour chaque réaction sur papier a été tracée au fil du temps par le logiciel intégré sur le lecteur de plaques portable PLUM. Les échantillons qui dépassaient le seuil ont été considérés comme positifs.
Les performances cliniques du capteur ont été établies par comparaison avec la RT-qPCR. Les échantillons ont été considérés comme positifs lorsque la valeur seuil du cycle était égale ou inférieure à 38. Il est important de s’assurer que les résultats des écrans de commutation et de la sensibilité de l’amorce NASBA sont reproductibles et optimisés avant de passer aux essais sur les patients.
Compte tenu de sa simplicité et de son adaptabilité, la plateforme de diagnostic décrite ici a ouvert la voie au développement de nouveaux outils au point de service qui peuvent apporter des avantages au système de santé, en particulier pour les pays à faible revenu.
