Ce protocole est important car il permet une manipulation ciblée spécifique dans le temps des placentas de souris à l’aide de CRISPR. Cela permettra aux chercheurs d’élucider des fonctions génétiques spécifiques au milieu ou à la fin de la grossesse. Les manipulations génétiques provoquant une surexpression dans le placenta de la souris sont très rares.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une gamme de changements d’expression génique dans le placenta. Ne vous découragez pas si les termes préliminaires ont cette technique sont infructueux. Comme cette technique est difficile, il faut un peu de temps pour s’entraîner à maîtriser.
Pour commencer, placez la mère anesthésiée en décubitus dorsal avec un cône nasal pour maintenir l’anesthésie dans la zone de préparation. Raser soigneusement l’abdomen du barrage. Pour éviter le séchage de la cornée, placez du gel lacrymal artificiel sur les deux yeux de la mère.
Ensuite, utilisez des applicateurs à embout de coton stérile pour désinfecter le site chirurgical avec au moins trois cycles alternés d’une solution de povidone iodée, suivie d’éthanol à 70% avec une couche finale de solution de povidone iodée. Après la préparation, déplacez la digue avec le cône nasal d’anesthésie vers la zone de chirurgie désignée. Pour la laparotomie utérine, placez la mère en décubitus dorsal sur la table d’opération et fixez le cône nasal en place avec du ruban adhésif.
Placez un coussin chauffant sous un tampon absorbant réglé à 45 degrés Celsius. Après avoir confirmé la profondeur de l’anesthésie par l’absence de reflux de pincement des orteils, utilisez des pinces et des ciseaux pour faire une incision médiane d’environ deux centimètres à travers la peau de la tente. Ensuite, faites une incision verticale à travers le péritoine à l’aide de forceps stériles, doucement tendues loin des cornes utérines.
Massez les deux cornes utérines en appuyant de chaque côté de l’abdomen avec les doigts pour les guider. Placez l’utérus exposé sur des champs chirurgicaux stériles placés sur le bas-ventre et maintenez-le humide avec des gouttes de solution saline stérile chaude si nécessaire. Une fois l’utérus exposé, sélectionnez trois paires de placentas pour la manipulation.
Enregistrer l’emplacement des manipulations placentaires et l’organisation des embryons dans les cornes utérines. Pour l’injection placentaire du plasmide témoin, charger une quantité suffisante du plasmide témoin approprié pour trois injections à l’aide d’une micropipette étalonnée. Effectuer toutes les injections entre la décidua et la zone jonctionnelle à une profondeur d’environ 0,5 millimètres latéralement dans le placenta.
Après l’injection mais immédiatement avant l’électroporation, enduisez les lieux de contact avec une solution saline stérile, en appliquant la solution saline précisément sur les trois sites de la paroi utérine et les palettes avec un compte-gouttes ou une seringue. Dans les deux minutes suivant l’injection, effectuez l’électroporation à l’aide d’une paire de palettes de trois millimètres fixées à une machine d’électroporation. Pour assurer l’efficacité de l’incorporation de CRISPR et la viabilité des embryons, réglez les réglages à 30 volts, impulsion de 30 millisecondes, deux impulsions, impulsion de 970 millisecondes éteinte et unipolaire.
Appuyez doucement sur les palettes d’électroporation sur les parois utérines sur les côtés latéraux du placenta. Placez la palette anodique sur le site d’injection et la cathode directement en face. Appuyez sur l’impulsion de la machine d’électroporation et attendez que les deux impulsions soient terminées avant de retirer les palettes d’électroporation.
Procédez ensuite à l’injection placentaire du plasmide expérimental comme démontré précédemment. Effectuer l’électroporation des trois placentas injectés expérimentaux dans les deux minutes suivant l’injection, comme cela a été fait pour le groupe témoin. Une fois la manipulation placentaire terminée, massez doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale en utilisant uniquement les doigts pour manipuler directement les cornes utérines.
Effectuer des sutures interrompues sur la couche du péritoine à l’aide de sutures solubles enduites et tressées de 45 centimètres de long avec un alliage d’aiguilles circulaires de 13 millimètres, trois huitièmes. Après avoir suturé la couche du péritoine, suturer la peau avec des sutures solubles en utilisant le même type de sutures solubles utilisées pour le péritoine. Une fois la suture terminée, appliquez de l’adhésif tissulaire sur les sutures de la peau.
Lorsque l’adhésif tissulaire a séché, éteignez le vaporisateur et transférez la digue de la zone chirurgicale à une cage de soutien sur son dos. Les placentas ont été injectés avec un plasmide de contrôle général CRISPR Cas9 et un plasmide de contrôle d’activation CRISPR ou un plasmide d’activation SAM IGF-1. Les images représentatives post-nécropsie n’ont montré aucun dommage notable ou changement dans l’apparence phénotypique dans les groupes de traitement.
Le taux de survie des embryons non traités dans les portées manipulées a diminué à une moyenne de 79,05%, tandis qu’il y avait une diminution significative de la survie des embryons manipulés avec une moyenne de 55,56%Il n’y avait pas de différence significative dans le poids placentaire d’aucun groupe. Il n’y avait pas de différence significative dans la prise de poids maternelle immédiatement après la chirurgie par rapport aux chirurgies simulées. De nombreuses mères enceintes ont montré une légère diminution ou aucun changement de poids le lendemain de l’intervention, probablement en raison de la perturbation de l’alimentation pendant et brièvement après la chirurgie.
La plupart des mères ont montré une augmentation du poids sur E14.5, mais parfois une diminution du poids a encore été observée. La qPCR a montré une augmentation significative de l’expression de l’IGF-1 dans les placentas de surexpression de l’IGF-1 par rapport aux placentas témoins. L’évaluation ELIZA des placentas E14.5 a montré une augmentation significative des taux de protéines IGF-1 dans les placentas de surexpression de l’IGF-1 par rapport aux placentas témoins.
L’autofluorescence verte a démontré les sous-régions de l’interface fœtale maternelle placentaire avec un marquage Cas9 rouge dans le placenta de surexpression IGF-1, indiquant une incorporation réussie de CRISPR dans les trois sous-régions du placenta. Le marquage par hybridation fluorescente dans C2 a confirmé l’incorporation du plasmide d’activation de l’IGF-1 sans migration dans les placentas non traités. La zone déciduale et la zone labyrinthique ont pu être identifiées autour de la zone jonctionnelle rouge marquée par la coloration Prl8a8.
N’oubliez pas d’enregistrer le type de manipulation et l’emplacement des placentas et des embryons correspondants. Il est fortement recommandé d’enregistrer l’emplacement du col de l’utérus et des embryons dans les cornes utérines. Après cette procédure, une analyse du placenta, de l’embryon et de la mère peut être effectuée.
Cela permettra une meilleure compréhension des rôles spécifiques des gènes placentaires dans la grossesse, la fonction placentaire et le développement embryonnaire.
