Les auteurs remercient la Fondation Armenise-Harvard, la Marie-Curie Trentin COFUND (ACS), la province autonome de Trento (Ecomm), et CIBIO de financement.

1. Préparation de la matrice d&#39;ADN <ol><li> Purifier plasmide à partir d&#39;une souche de laboratoire standard de E. coli, tels que E. coli DH5a ou en Nouvelle-bleu avec un kit commercial. Alternativement, un produit PCR linéaire peut être purifié même avec un kit commercial. On élue l&#39;ADN avec H 2 O seulement. </li><li> Phénol-chloroforme extraire la solution d&#39;ADN 26. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ADN et de la pureté, par exemple par absorbance UV ou d&#39;autres méthodes appropriées. Il est important d&#39;utiliser l&#39;ADN de haute pureté pour l&#39;efficacité de transcription-traduction. </li></ol> 2. Préparation de la Lipid Thin Film <ol><li> Peser la poudre lipidique sec et dissoudre dans un solvant. Pour 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), les solutions mères sont préparées dans du chloroforme à une concentration de 40 mg / ml. Note: solvants organiques doivent être manipulés avec des pipettes en verre et de bouteilles. En d&#39;autres termes, le plastique ne doit jamais être utilisé. S Storesolutions tock dans serrés, solvants bouteilles en verre de couleur ambre résistant à l&#39;air à -20 ° C, de préférence sous argon. </li><li> Aliquote 12 pmol POPC (220 ul de 40 mg / ml de solution mère) dans un ballon à fond rond de 5 ml. </li><li> On évapore le solvant à l&#39;évaporateur rotatif (figure 1) pour générer le film lipidique mince. <ol><li> Fixer fermement le ballon à fond rond pour le tube de distillation avec une pince circulaire et démarrer la rotation du ballon. </li><li> Initier la circulation de l&#39;eau à travers le serpentin de condenseur. L&#39;utilisation d&#39;un bain de chaleur n&#39;est pas nécessaire, parce que le chloroforme a un faible point d&#39;ébullition de 61,2 ° C à la pression atmosphérique normale. </li><li> Assurez-vous que le système est ouvert à l&#39;atmosphère par vérifier que le robinet est ouvert. Tournez sur la pompe à vide et fermer lentement le robinet d&#39;appliquer le vide pour le système. </li><li> Un film mince de lipides se dépose sur les parois du ballon à fond rond pendant l&#39;évaporation rotative formant un film opaquece qui est visible à l&#39;œil nu. Soit l&#39;évaporation rotative continuer à 0,5-2 h. Pour arrêter le processus, relâchez lentement la pression de vide, arrêter la rotation, et enlever le ballon à fond rond. </li></ol></li></ol> 3. La remise en suspension des lipides et l&#39;homogénéisation des vésicules <ol><li> Ajouter 1 ml 18,2 MQ H 2 O pour le film lipidique mince directement dans le ballon à fond rond. Vigoureusement vortex de la solution à la vitesse maximale, soit environ 3200 tours par minute, jusqu&#39;à ce que le film lipidique se détache du verre, qui est observable à l&#39;oeil nu. </li><li> Transférer la dispersion lipidique dans un tube de 2 ml. </li><li> Mise en place d&#39;un anneau support pour tenir une homogénéisation avec une pointe de 5 mm. Placer une cale de centrifugation ci-dessous l&#39;homogénéisateur pour tenir solidement la dispersion des lipides. Rincez l&#39;élément de dispersion de l&#39;homogénéisation en plongeant la pointe dans 18,2 MQ H 2 O et courir pendant quelques secondes. </li><li> Placer l&#39;élément de dispersion directement dans la dispersion lipidique assurant èmeà la pointe ne touche pas le fond du tube de centrifugation. Homogénéiser pendant 1 min à puissance 4 ou 14.000 tours par minute. </li></ol> 4. Extrusion des vésicules et lyophilisation <ol><li> Assembler les parties de la mini-extrudeuse (figure 2), qui se compose d&#39;une enveloppe extérieure et d&#39;un écrou de retenue qui loge deux membrane Téflon interne prend en charge, les deux joints toriques, et un palier en téflon. <ol><li> Placer les deux joints toriques dans les rainures des supports de membrane interne. Pré-imbibé deux filtres et une membrane de 400 nm. Les filtres seront placés contre le Teflon à l&#39;intérieur des joints toriques avec la membrane entre eux. </li><li> Placer la membrane prend en charge dans la gaine à l&#39;extrudeuse avec la membrane entourée de deux filtres en entre les joints toriques. Placer le roulement Teflon l&#39;intérieur du boîtier et fixez l&#39;écrou de retenue et serrer à la main. </li></ol></li><li> Rincer deux seringues et de remplir un avec 18,2 MQ eau. Insérer les aiguilles de seringues dans le petit holes du téflon sur chaque extrémité de l&#39;ensemble d&#39;extrusion. Les aiguilles doivent glisser facilement, ne forcez pas les aiguilles. Fixez l&#39;extrudeuse avec les seringues dans le boîtier extrudeuse et coudre. </li><li> Faire passer l&#39;eau à travers l&#39;extrudeuse en poussant doucement l&#39;eau sur une seringue et dans l&#39;autre. Cela représente un passage. Répétez l&#39;opération pour un total de trois passages assurant qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites actuelles. Retirez la seringue de l&#39;eau et de disposer de l&#39;eau. </li><li> Remplir une seringue avec l&#39;échantillon, attacher à l&#39;extrudeuse, et passer lentement la solution de vésicules à travers la membrane tel que décrit ci-dessus à l&#39;étape 4.3. Répétez 10 fois pour un total de 11 passages. Comme le procédé d&#39;extrusion produit, l&#39;échantillon sera moins trouble et plus facile à pousser à travers la membrane. Une baisse soudaine de la résistance, cependant, indique généralement une rupture de la membrane. </li><li> Transférer la solution de la vésicule extrudé et faire 40 aliquotes des vésicules dans des microtubes.Un gel chaque aliquote soit dans de la neige carbonique ou l&#39;azote liquide. </li><li> Lyophiliser chaque aliquote avec un évaporateur centrifuge pendant la nuit à 30 ° C. Stocker les vésicules vides lyophilisés à -20 ° C. </li></ol> 5. Encapsulation transcription-traduction Machinery <ol><li> Mélanger les composants de la réaction de transcription-traduction et ajouter 20 unités d&#39;inhibiteur de RNase. Incuber sur de la glace. </li><li> Ajouter la matrice d&#39;ADN. Pour obtenir une réaction de contrôle, 250 ng de plasmide mVenus de codage ou une protéine fluorescente similaire derrière un promoteur de transcription T7 et une forte E. coli site de liaison de ribosome est recommandé. </li><li> Porter le volume final de 25 pi avec de l&#39;eau sans RNase. </li><li> Hydratez une aliquote de vésicules lyophilisés (de l&#39;étape 4.6) avec 10 pl de la réaction assemblé à l&#39;étape 5.3. vortex brièvement le mélange jusqu&#39;à ce que les vésicules sont remises en suspension. Cela devrait prendre moins de 30 secondes. </li><li> Incuber la réaction sur la glace pendant 30 min pour permettre aux vésicules à gonfler. </li><li> Diluer le mélange de la vésicule 20 fois pour un volume final de 30 pi en ajoutant 1,5 ul de vésicules dans 27,0 ul de 50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, pH 7,4 et 1,5 ul de 20,2 mg / ml protéinase K. DNase et RNase peuvent également être ajoutés à ce stade comme une alternative à la protéinase K à dégrader matière extravésiculaire. </li><li> Incuber pendant au moins 2,5 h à 37 ° C. </li></ol> 6. Microscopie <ol><li> Examiner les vésicules et les progrès de la production de la protéine fluorescente à différents points dans le temps. Les vésicules auront un diamètre plus grand que les pores de 400 nm de taille de la membrane utilisée pour l&#39;extrusion de la vésicule. <ol><li> Préparer une chambre d&#39;échantillon en plaçant un x 5 mm entretoise 20 de silicium sur une lame de microscope standard. Pipette 10 pl de vésicules dans la chambre de l&#39;échantillon. Placez une siliconé lamelle de verre sur la chambre. </li><li> Respecter les vésicules avec un 63X huile dispersion or objectif similaire par champ lumineux et la microscopie de fluorescence en utilisant l&#39;ensemble de filtre correspondant pour la protéine fluorescente exploité. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Bien que la biologie synthétique acellulaire est encore à ses balbutiements, des progrès ont jeté une base à partir de laquelle les systèmes cellulaires comme de plus en plus complexes peuvent être faites. La reconstitution de la machinerie de transcription-traduction à partir de composants entièrement défini 9 à l&#39;intérieur de vésicules 28 a été particulièrement important en facilitant les efforts ultérieurs dans la construction artificielle soucieux de l&#39;environnement cells17, 18. De même, les études sur les cellules artificielles ont été utilisés pour sonder les processus évolutifs 4,29,30, les détails mécanistiques de la synthèse d&#39;ARN et de protéines 22,31, les influences de métabolique load32, 33 ans, et l&#39;assemblage des particules virales 34. Surtout, suffisamment de connaissances existe maintenant que la fonction cellulaire de base peut être reconstitué à l&#39;intérieur de vésicules dans le laboratoire suite à ces précédents rapports et les protocoles décrits ici. En plus d&#39;être facile, l&#39;encapsulation décrite procedure a plusieurs avantages. Par exemple, de nombreux vides, portions de vésicules lyophilisés peuvent être faites à l&#39;avance et stockés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Le protocole n&#39;est pas soumis molécules biologiques aux solvants organiques, les changements brusques de température, ou de longues périodes de dialyse. Nous nous attendons à ce que la douceur de la procédure facilitera l&#39;intégration de composants supplémentaires au besoin. Nous avons également pas été observé d&#39;effets défavorables pour modifier la composition lipidique de la membrane sur l&#39;encapsulation ou l&#39;efficacité de transcription-traduction. Par conséquent, les lipides plus favorable à l&#39;incorporation de protéines membranaires, des morphologies spécifiques, ou la visualisation pourraient éventuellement être exploitées. La principale limite de la méthode décrite est que les vésicules résultantes ne sont pas homogènes en taille ou lamellarité. Pour de nombreuses applications, ces difficultés ne nuisent pas à l&#39;interprétation des données. Toutefois, si nécessaire, des mesures supplémentaires peuvent être incorporés à th étroitdistribution de la taille de l&#39;e et de diminuer les couches de membranes, telles que des cycles supplémentaires de l&#39;extrusion après l&#39;encapsulation, de gel-dégel, ou de dialyse 35. Sans doute de meilleures méthodes permettant de contourner ces problèmes et d&#39;autres seront développés. Jusque-là, nous trouvons le protocole décrit ici à être bien adapté pour la construction de mimiques cellulaires.

Acellulaire in vitro réactions transcription-traduction et la production de vésicules de lipides synthétiques ne sont pas nouvelles. Cependant, la combinaison des deux dans un cellulaire imiter est nettement plus challenging1-6. E. des extraits de cellules de E. coli avec ou sans T7 ARN polymérase ne peuvent être utilisés en tant que source de la machinerie de transcription-traduction 7,8. Des extraits cellulaires avantage de la présence d&#39;autres composants cellulaires qui peuvent faciliter l&#39;expression de protéines et de pliage. Alternativement, un mélange d&#39;ARN purifiés individuellement et les molécules de protéines, c&#39;est à dire le système PURE 9, peut être utilisé comme intermédiaire pour la synthèse des protéines intravésiculaire 4,10-14. Le système PURE permet la construction de mimiques cellulaires entièrement définis et ne souffre pas de l&#39;activité nucléase trouvé dans les extraits cellulaires. Pratiquement, cela signifie que beaucoup moins matrice d&#39;ADN est nécessaire, ce qui facilite les processus avec une faible efficacité d&#39;encapsulation 11 </sup&gt;. Bien que moins fréquemment utilisés, imite cellulaires peuvent être construits avec des extraits cellulaires dérivées de eucaryote cells15. Jusqu&#39;à présent, les cascades encapsulées codées génétiquement et imite cellulaires qui captent l&#39;environnement ont été signalés 16-18. Le plus simple pour surveiller les effets transcription-traduction est de mesurer la fluorescence ou luminescence d&#39;éléments génétiquement codés. En règle générale, la luciférase de luciole 19 ou GFP sont utilisés, bien in vitro réactions sont souvent mesurés par marquage radioactif. La détection par fluorescence permet en outre pour le suivi des populations de vésicules 20,21 par des méthodes basées sur la cytométrie, offrant ainsi un aperçu de la nature stochastique des processus biologiques comparables. Ces méthodes de surveillance ont été utilisées pour définir un petit ensemble de règles de conception et d&#39;une bibliothèque de pièces à partir de laquelle construire à partir, y compris une collection de protéines fluorescentes qui sont compatibles avec in vitro transcription-traduction 22, l&#39;influence de l&#39;organisation génétique sur l&#39;expression 22, l&#39;activité des facteurs sigma 16, et l&#39;efficacité de terminaison de la transcription 23. Néanmoins, il reste beaucoup qui doit être fait pour augmenter la capacité de construire prévisible in vitro, des dispositifs codées génétiquement. Il existe de nombreuses méthodes disponibles pour faire des vésicules. Les méthodes les plus courantes dépendent de la génération d&#39;un film lipidique mince sur une surface de verre, suivie par remise en suspension dans une solution aqueuse Solution24. Si la solution aqueuse contient machines transcription-traduction, par exemple, une fraction des vésicules formées contiendrait les éléments nécessaires pour la production de protéines. Cependant, le rendement d&#39;encapsulation de tels procédés est faible, ce qui signifie que seulement une faible proportion des vésicules sont actifs. Beaucoup de méthodes alternatives caractérisées par beaucoup plus eff d&#39;encapsulationiciency exploiter la conversion des gouttelettes de l&#39;émulsion eau-dans-huile à des vésicules. Bien qu&#39;il soit probable que ces méthodes seront monnaie courante dans l&#39;avenir, pour le moment ces méthodes souffrent de la nécessité d&#39;un équipement spécialisé et donnent des vésicules avec la membrane compositions modifiées 25. Un avantage particulier de l&#39;eau-dans-huile à des procédés de la vésicule est le potentiel de contrôle de lamellarité de la membrane. Le procédé décrit ici est basé sur le protocole de couche mince de lipide décrit par le laboratoire Yomo 11 avec de légères modifications, notamment une étape d&#39;homogénéisation complémentaire. Cette méthode est facile, pas cher, et donne des vésicules robustes et adaptés pour l&#39;encapsulation des machines transcription-traduction.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

En quarts de travail d&#39;intérêt à partir de molécules individuelles à des systèmes de molécules, un nombre croissant de laboratoires ont cherché à construire de bas en haut imite cellulaires qui représentent mieux la complexité de la vie cellulaire. À ce jour, il ya un certain nombre de chemins qui pourraient être prises pour renforcer imite cellulaires compartimentées, y compris l&#39;exploitation des émulsions eau dans huile, des dispositifs microfluidiques et des vésicules. Chacune des options disponibles a des avantages et des inconvénients spécifiques. Par exemple, les émulsions eau-dans-huile donne une grande efficacité d&#39;encapsulation, mais ne reproduisent pas bien la barrière de perméabilité des cellules vivantes. Le principal avantage des méthodes décrites ici, c&#39;est qu&#39;ils sont tous facile et pas cher à mettre en œuvre. Machines transcription-traduction est encapsulé à l&#39;intérieur de vésicules de phospholipides par un processus qui exploite l&#39;instrumentation commune, comme un évaporateur centrifuge et une extrudeuse. Les réactions sont suivies par spectroscopie de fluorescence. Le protocoles peuvent être adaptés pour l&#39;expression de protéines recombinantes, la construction de mimiques cellulaires, l&#39;exploration des exigences minimales de la vie cellulaire, ou l&#39;assemblage de circuits génétiques.

La microscopie à fluorescence révèle que la fluorescence est observée uniquement à l&#39;intérieur des vésicules, parce que le matériel extravésiculaire est dégradé par voie enzymatique (figure 3). Pour l&#39;expression de mVenus, intravésiculaire fluorescence commence à être observée au bout de 1,5 heures à 37 ° C et atteint l&#39;intensité de fluorescence maximale dans 6 h. La température optimale et le temps d&#39;incubation peut varier en fonction des constructions spécifiques utilisés. Par exemple, différentes protéines fluorescentes mûrissent très différemment d&#39;une manière dépendante de la température. En d&#39;autres termes, l&#39;observation de la production de protéines n&#39;est pas uniquement dépendant de la synthèse des protéines et le pliage mais aussi sur la formation du chromophore. Synthèse globale des protéines peut être augmentée en incorporant les pores de la protéine de membrane pour permettre l&#39;afflux des composants épuisés nécessaires à la transcription et à la traduction 27. Il est recommandé d&#39;effectuer un analogue transcription traduction réaction en l&#39;absence de vésicules à ce que la construction génétique est exploité fonctionnelle. Cette réaction de contrôle est plus facilement contrôlée par spectroscopie de fluorescence plutôt que la microscopie. Figure 4 montre une réaction de transcription-traduction in vitro d&#39;une construction mVenus d&#39;encodage. Réactions non encapsulées donner beaucoup plus intensités de fluorescence totaux que intravésiculaires réactions similaires. Cela est dû à l&#39;efficacité d&#39;encapsulation et parce que le volume total de intravésiculaire est beaucoup moins que le volume extravésiculaire (soit un effet de dilution). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. L&#39;évaporateur rotatif et pompe à vide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . Figure 2. L&#39;logement et des parties de l&#39;extrudeuse sont présentés séparément. De gauche à droite, une seringue, écrou de retenue, roulement en téflon, membrane interne prend en charge avec des joints toriques noirs face de l&#39;autre, extrudeuse enveloppe extérieure et la deuxième seringue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Figure 3 images de fluorescence de la production de protéines mVenus dans des liposomes A et C:.. Des images de fond clair de vésicules multilamellaires après 1,5 h et 2,5 h et B &amp;# 160; D: La production de mVenus est visualisé par fluorescence (couleur verte) après 1,5 et 2,5 heures, respectivement. Barre d&#39;échelle est de 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4. Dans la réaction de contrôle in vitro de non encapsulé transcription in vitro et la traduction de mVenus. L&#39;intensité de fluorescence a été mesurée toutes les 5 min pendant 4 heures. Les données ont été acquises avec un instrument PCR en temps réel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Ici, nous décrivons des méthodes simples pour la préparation de vésicules, l&#39;encapsulation de la transcription et de la machinerie de traduction, et le suivi de la production de protéines. Les systèmes sans cellules résultantes peuvent être utilisées comme point de départ pour construire imite cellulaires de plus en plus complexes.

L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K vues.  University of Trento.  Ici, nous décrivons des méthodes simples pour la préparation de vésicules, l'encapsulation de la transcription et de la machinerie de traduction, et le suivi de la production de protéines. Les systèmes sans cellules résultantes peuvent être utilisées comme point de départ pour construire imite cellulaires de plus en plus complexes. 

Vidéo: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Une méthode pour l&#39;encapsulation follicule ovarien et de la Culture dans un protéolytiquement dégradable 3 Système dimensionnelle

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Recherche

Bio-ingénierie

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Construction de feuilles d&#39;hydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3D Cellular architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash Nanoprécipitation pour l’Encapsulation des composés hydrophobes et hydrophiles en nanoparticules polymériques

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Modélisation par éléments finis d’un microenvironnement électrique cellulaire

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

Des cellules à la synthèse de protéines sans cellules en 24 heures à l’aide d’un flux de travail d’auto-induction sans cellules

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Une boîte à outils de transcription-traduction de streptomyces à haut rendement pour la biologie synthétique et les applications de produits naturels

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular processes in vitro. In recent years, encapsulation within GUVs has proven to be a helpful approach for reconstitution experiments in cell biology and related fields. It better mimics confinement conditions inside living cells, as opposed to conventional biochemical reconstitution. Methods for encapsulation inside GUVs are often not easy to implement, and success rates can differ significantly from lab to lab. One technique that has proven to be successful for encapsulating more complex protein systems is called continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Here, a cDICE-based method is presented for rapidly encapsulating cytoskeletal proteins in GUVs with high encapsulation efficiency. In this method, first, lipid-monolayer droplets are generated by emulsifying a protein solution of interest in a lipid/oil mixture. After being added into a rotating 3D-printed chamber, these lipid-monolayered droplets then pass through a second lipid monolayer at a water/oil interface inside the chamber to form GUVs that contain the protein system. This method simplifies the overall procedure of encapsulation within GUVs and speeds up the process, and thus allows us to confine and observe the dynamic evolution of network assembly inside lipid bilayer vesicles. This platform is handy for studying the mechanics of cytoskeleton-membrane interactions in confinement.

This article introduces a simple method for expeditious production of giant unilamellar vesicles with encapsulated cytoskeletal proteins. The method proves to be useful for bottom-up reconstitution of cytoskeletal structures in confinement and cytoskeleton-membrane interactions.

Encapsulation rapide du cytosquelette reconstitué à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...