L’objectif global de cette procédure est de surveiller les changements dans les concentrations de calcium cytosolique dans les cellules vivantes pour différencier les réponses neuronales ou gliales en fonction du chlorure de potassium ou des stimuli ATP. Le calcium est un deuxième messager important impliqué dans plusieurs processus cellulaires, y compris la neurotransmission, la plasticité et l’apoptose. L’avènement du colorant calcique fluorescent hautement sélectif, tel que Fura-2 AM, associé au développement de meilleurs microscopes fluorescents et méthodes de calcul, a produit des données optiques à haute résolution avec un degré élevé de résolution spatiale et temporelle pour imager la signalisation du calcium sur les cellules et les organismes vivants.
Ce protocole est adaptable aux neurones enrichis, à la glie purifiée ou aux cultures de populations mixtes. Il suit les types de cellules qui ont répondu à des stimuli déterminés en fonction de la réponse différentielle au chlorure de potassium et à l’ATP. Le chlorure de potassium modifie le potentiel membranaire de la cellule.
Et cela ouvre des canaux calciques dépendants de la tension, exprimés essentiellement par les neurones. D’autre part, l’ATP active le canal P2X7 à grande partie, présent principalement dans les cellules gliales. En couplant les stimuli du chlorure de potassium et de l’ATP avec d’autres médicaments, il est possible de voir quel compartiment du système nerveux y répond, en fonction de l’augmentation de la concentration intracellulaire de calcium.
Pour cette procédure, vous aurez besoin d’instruments chirurgicaux ou de pinces à épiler. Utilisez une armoire de biosécurité et appliquez les meilleures pratiques pour éviter la contamination. Pour commencer la culture de la rétine de poulet, ouvrez soigneusement un ovule fécondé par le fond, où se trouve la cellule d’air.
Retirer le contenu dans une boîte de Pétri et procéder au don d’embryons par décapitation avec une pince à épiler. Une fois la tête retirée, apportez-la dans une boîte de Petri propre et ajoutez-y une solution sans calcium et sans magnésium. Ensuite, retirez les yeux en prenant soin de ne pas les endommager dans le processus.
Amenez l’œil à une autre boîte de Petri contenant une solution de CMF. Avec une pince à épiler, commencez à disséquer l’œil en retirant la lentille. Ensuite, en commençant par le trou laissé par la lentille, faites trois ou quatre coupes longitudinales dans l’œil.
Retirez le corps vitré transparent avec prudence. Assurez-vous que la rétine ne s’y lie pas. Ensuite, détachez doucement la rétine de l’épithélium pigmenté.
Enlevez tout tissu épithélial restant. Lorsque la rétine est totalement claire, coupez-la en petits morceaux. Prenez tout le tissu de la rétine à l’aide d’une pipette automatisée.
Centrifugez brièvement la rétine pour éliminer tout le CMF. Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine. Et incuber le tissu à 37 ° C pendant 10 minutes.
Arrêter la réaction de la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu contenant 10% de sérum de veau fœtal. Centrifuger la rétine pour enlever toute la trypsine. Lavez les cellules deux ou trois fois avec un milieu contenant 10% de FCS.
Ensuite, ajoutez 2 mL de milieu par rétine et dissociez-le doucement mécaniquement. Diluez les cellules afin de pouvoir les compter correctement avec un hémocytomètre. Utilisez des couvercles de 15 mm protégés par de la poly-L-lysine et de la laminine pour faciliter l’adhésion cellulaire.
Pipette 50 L de vos cellules diluées sur chaque couvercle. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère à 5% de CO2. Et refroidissez-les pour fixer le verre.
Cela devrait prendre environ une à deux heures. Ajouter 1 mL de milieu et le remettre à l’incubateur jusqu’au jour de l’expérience. Si nécessaire, changez la moitié du milieu tous les deux à trois jours.
Reconstituer un flacon de 50 g de Fura-2 AM avec 50 L de DMSO. La solution de Krebs est une bonne option pour transférer des cellules pendant l’expérience, car elle n’interfère pas avec la mesure de la fluorescence. Préchauffer la solution à 37 avant de commencer.
Ajouter Poloxamer 407. Ajoutez Fura-2 AM et DMSO. Soniquez-le pendant sept minutes au bain-marie.
Préparez une plaque de 6 puits en ajoutant la solution de Krebs à trois puits et la solution de Fura-2 de travail sur un autre. Lavez le couvercle contenant vos cellules trois fois avant de l’ajouter au puits Fura-2. Incuber les cellules à 37 C et 5% de CO2 sous atmosphère pendant 30 minutes dans un incubateur sombre.
Après l’incubation, lavez-le trois fois à nouveau. Transférez-le à un autre récipient contenant krebs et protégez-le de la lumière. Il est possible de réutiliser le Fura-2 préparé pour incuber plus de couvercles avec des cellules.
Ajoutez du silicium au support et à la chambre de recouvrement avant chaque exécution pour éviter les fuites de solution. Retirez le couvercle de la solution de Krebs et lavez soigneusement le fond avec de l’eau distillée pour éviter la cristallisation du sel sur la lentille du microscope. Placez le couvercle sur le support, en appuyant sur les bordures avec prudence.
Fixez le support et la chambre du couvercle au microscope et commencez à infuser les cellules avec une solution de Krebs. Sélectionnez les cellules appropriées et choisissez un bon champ. Déterminez manuellement les régions d’intérêt en sélectionnant les corps cellulaires en fonction de leur morphologie distincte.
Les variations de la concentration en calcium ont été évaluées en quantifiant le rapport de la fluorescence émise à 510 nm après une excitation alternative à 340 et 380 nm. Après avoir ajouté du chlorure de potassium, il est possible de voir de nombreuses cellules briller et la réponse de fluorescence augmenter sur le graphique. Le chlorure de potassium ouvre des canaux calciques dépendants de la tension, se présente principalement dans les neurones.
Chaque ligne individuelle du graphique représente la région d’intérêt unique. Par conséquent, il est possible de suivre les réponses individuelles des cellules pendant l’expérience. Les stimuli ATP ouvrent le récepteur P2X7, essentiellement exprimé par les cellules gliales.
Il s’agit d’une culture neuronale enrichie. Par conséquent, il y a peu de cellules gliales ici. C’est la raison pour laquelle si peu de cellules répondent aux stimuli de l’ATP.
Les valeurs acquises ont été traitées à l’aide du logiciel Metafluor. Les résultats expérimentaux sont exprimés dans un tableau Excel, où chaque ligne représente une cellule individuelle et chaque ligne, un point temporel. À l’aide du logiciel Excel, il est possible de tracer les variations de calcium des cellules individuelles séparément, ou de toutes sur le même graphique.
Pour quantifier la quantité de cellules réactives à n’importe quel stimulus, fixez un seuil de 30% augmentant les niveaux de calcium de base. Ici, nous utilisons des cellules de la rétine en culture à partir du jour embryonnaire 8 poussins pour étudier comment les neurones et la glie signalent en termes de changement de calcium, après avoir reçu 50 mm de chlorure de potassium et 1 mm de stimuli ATP. Dans chaque expérience, environ 100 cellules ont été facilement analysées.
La figure A représente une culture mixte contenant à la fois des neurones et une glie, qui a été maintenue pendant une semaine. Lorsque nous quantifions les réponses, il est possible de voir qu’environ la moitié des cellules analysées répondent au chlorure de potassium et que l’autre moitié répond à l’ATP. La figure B fait référence à une culture enrichie en neurones.
Il a été incubé pendant seulement trois jours, par conséquent, la plupart des cellules gliales ne se sont pas encore différenciées. Dans ce cas, 89% des cellules répondent au chlorure de potassium, ce qui renforce la prévalence des neurones. La figure C montre une culture gliale purifiée.
Ces cellules ont été maintenues pendant 10 jours avec des changements de milieu tous les trois jours. Après ce temps, la plupart des neurones meurent, ne laissant que la glie. En effet, cette culture n’a été activée que par l’ATP.
Cette méthodologie a été largement utilisée en raison des propriétés universelles du calcium en tant que deuxième messager. L’analyse phénotypique peut être améliorée en complétant cette méthodologie par l’immunochimie des cellules fixes après imagerie calcique. Ce protocole pourrait également être adapté à d’autres systèmes cellulaires mixtes exprimant d’autres canaux calciques.
L’astuce importante est de trouver des réponses sélectives de différents types de cellules corrélées à leur expression phénotypique.
