Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DC007681, AB), CT cellules souches subvention (AB), Pardee fondation (AB), Ruth L. prédoctorale Kirschstein national de recherches des bourses (NRSA) (SZY), et un NSF Graduate Research Fellowship (BL). Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Bordey des commentaires utiles sur le manuscrit. Le matériel actuel est basé sur le travail soutenu en partie par l&#39;État du Connecticut Connecticut sous la tige subventions Cellulaire Programme de recherche. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;État du Connecticut, le ministère de la Santé publique de l&#39;État du Connecticut CT ou des innovations, Incorporated.

1. Préparation des solutions, Dissection, et Vibratome <ol><li> Les solutions doivent être préparées à l&#39;osmolarité et le pH correct (tableau 1). Par rapport au liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), la solution de dissection est préparé avec de faibles concentrations de sodium et de calcium, et de fortes concentrations de magnésium. Il s&#39;agit de minimiser les effets excitotoxicité pendant le tranchage. </li><li> Les deux solutions de dissection et ACSF doit être saturée avec 95% O 2/5% de CO 2 par barbotage pendant au moins 10 minutes pour atteindre le pH désiré de 7,3. </li><li> Préparer un bain de glace sur un plateau. Placez une plaque de dissection dans le bain de glace et remplir avec une solution de dissection. Bubble la plaque de dissection. </li><li> Préparer le vibratome en créant un bain de glace. Placer le plat de sectionnement dans le bain de glace, remplir la cuve avec une solution de dissection, et la bulle. </li><li> Remplissez la tranche chambre de retenue avec ACSF et la bulle afin d&#39;assurer que la solution soit suffisamment aéré quel que soitoù des tranches sont placées. </li></ol> 2. Élimination des tissus cérébraux Tranches cérébraux aigus ont tendance à être en meilleure santé avec de jeunes souris. L&#39;architecture cellulaire SVZ postnatale à des rongeurs est mature vers le jour postnatal (P) 20 1. Par conséquent, nous essayons de limiter nos expériences à l&#39;âge de la souris P20-P30, mais nous avons réalisé des expériences réussies chez des souris aussi vieux que 3 mois. Tout au long de la manipulation des tissus, il faut se garder de minimiser les mouvements mécaniques et de la pression dans le cerveau, maintenir des conditions de refroidissement, et d&#39;exposer la SVZ à la solution le plus rapidement possible suivant sacrifice. <ol><li> Après l&#39;injection de pentobarbital, la souris est rapidement décapité. La fourrure est enlevée et les incisions sont faites à travers la base du crâne. La tête est ensuite placé dans un bac rempli d&#39;une solution de dissection. </li><li> Alors que la stabilisation de la tête avec une pince, les coupes continues sont faites autour du crâne et parfois jusqu&#39;à la ligne médiane avec Microscissors. Attention pour minimiser le contact avec le tissu. Depuis le bulbe olfactif est la destination finale des nouveaux neurones de la SVZ, il faut tenir compte de la préservation de cette région, en particulier lors de l&#39;enlèvement des os autour de cette zone. Microscissor coupes faites autour du crâne doit être sur la face dorsale, afin de permettre un retrait facile du crâne. </li><li> Suppression du crâne recouvrant le cerveau est maintenant séparé de l&#39;os sous le cerveau. Si des coupes dans l&#39;étape précédente sont faites correctement, cet os sus-jacente peut être enlevé facilement avec des ciseaux ou des pinces. </li><li> Tout en maintenant la tête avec une pince, on peut utiliser une lame chirurgicale pour enlever proprement plusieurs morceaux de tissu cérébral avant le tranchage, telles que les suivantes. Une coupe coronale peuvent être faites au niveau du lambda. Coupes sagittales peuvent être faites sur les deux côtés du cerveau en dehors de la SVZ. Une estimation prudente serait ~ 2,5 mm de la ligne médiane. Si vous le souhaitez, le cerveau peut aussi être hemisected ici. Ces réductions seront tous deux faciliter le montage du tissu et permettre la SVZ être atteint plus rapidement lorsque le cerveau trancher. Il est important de se rappeler d&#39;exercer le minimum de forces mécaniques sur le cerveau (par exemple ne pas pousser ou tirer). </li></ol> 3. Aiguë Préparation de tranches de cerveau <ol><li> Pour préparer les étapes suivantes, s&#39;assurer que la super glue utilisé pour monter le tissu est exempt de sabots et prêts à appliquer à la plaque vibratome. Il est important d&#39;aller aussi vite que possible sans endommager le cerveau. </li><li> Le tissu cérébral peut alors être ramassé par le dessous, qui sépare le tissu de l&#39;os sous-jacent, tout en séparant les nerfs. </li><li> Le tissu est monté et collé sur une plaque et placé sur le vibratome. En raison de l&#39;anatomie rostro-caudale de la SVZ, nous nous sommes concentrés sur les coupes sagittales faire car il préserve la voie migratoire des neuroblastes, la gaine gliale, et la vascularisation qui sont en grande partie alignée dans cette direction. On peut soit moUNT du tissu ou sur la ligne médiane de la surface plane créée par des coupes sagittales latérales de la SVZ. Une étape facultative consiste à placer un bloc de 3% d&#39;agarose derrière le tissu à servir de butée à la lame lorsque les tranches se détacher. Nous utilisés de préférence à base de cyanoacrylate super glue. </li><li> Rincer la lame avec de l&#39;éthanol pour éliminer les huiles et rincer avec de l&#39;eau distillée. Placer la lame sur le porte-lame. Monter le support de lame à la vibratome. </li><li> Réglez les paramètres vibratome pour couper le tissu avec une épaisseur de 250-350 um par tranche. Il est important de couper l&#39;aide de vibrations à haute fréquence et à basse vitesse. </li><li> Section progressivement à travers le tissu. L&#39;apparition du bulbe olfactif est un bon indicateur que l&#39;on est près de la SVZ en coupes sagittales que les tranches les plus latérales contiendront aucune des deux régions. Autres sites à surveiller comprennent le ventricule et l&#39;épaississement du corps calleux, sous laquelle se trouve la SVZ. La SVZ apparaissent en premier dans sagit latérale plustranches mentales. Le RMS apparaîtra dans coupes sagittales médianes. </li><li> Retirer les tranches contenant la SVZ avec une pipette Pasteur en plastique avec la pointe coupée. Transfert vers la chambre de retenue tranche. Nous avons souvent obtenir plus de tranches que nous pouvons utiliser dans une journée de travail. Cependant, tranches varie de la quantité de cellules contenant la SVZ. Il est parfois nécessaire de regarder à travers plusieurs tranches de trouver celui qui vous intéresse pour l&#39;imagerie. </li></ol> 4. Préparation du microscope et colorants Les tranches besoin d&#39;un temps d&#39;incubation d&#39;une heure dans ACSF à se remettre de la dissection et de tranchage. Plusieurs mesures peuvent être effectuées au cours de cette période de récupération tranche. <ol><li> Préparation de pipettes pour la teinture de calcium et / ou demande de drogue <ol class="lalpha"><li> Pipettes en verre doivent avoir un bout de 2-3 um de diamètre et d&#39;une longueur de pointe (~ 2 mm) et angle (~ 16 ° pour le porte-pipette) qui empêche le contact avec la chambre de perfusion et laisse de la place pour le placement del&#39;objectif. </li><li> On peut généralement préparer 6-8 pipettes de pression pour chaque jour d&#39;expériences. </li></ol></li><li> Préparation de colorant Calcium <ol class="lalpha"><li> Lors de la préparation de la solution de travail (4-5 uM de bain, 250 uM par application de pression), il est préférable d&#39;exposer le minimum de DMSO pour les cellules. Ceci peut être réalisé en faisant des stocks hautement concentrées. Par exemple, pour Fluo-4, un tube contenant 50 ug par jour est utilisée. On peut faire un stock de 10 mM de cette aliquote en ajoutant 4,6 pi de solution de Pluronic F-127 à 20% dans le DMSO. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;installation microscope (Figure 2). <ol class="lalpha"><li> Utilisation d&#39;une pompe péristaltique pour écoulement de la solution a permis de réduire la dérive d&#39;image. Faites fonctionner la pompe péristaltique avant de permettre ACSF à courir à travers les lignes de perfusion et de s&#39;assurer qu&#39;il est exempt de bulles. </li><li> Réglez l&#39;entrée du tube de la chambre de perfusion et de s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuites. </li><li> Positionner la pointe vide pour ensure que la solution est aspirée de la chambre de perfusion. Assurez-vous qu&#39;il est à un niveau suffisant pour que l&#39;objectif est immergé à la bonne distance de travail, mais pas assez élevée pour que la solution peut se répercuter sur la chambre. Un faible niveau de solution permettra également de minimiser les distorsions de flux. Une aspiration constante peut également être vérifié par l&#39;écoute de solidité. </li></ol></li></ol> 5. Colorant de charge Cette méthode a été décrite en détail dans un autre manuscrit 2. S&#39;il vous plaît voir les figures ci. <ol><li> Colorant de chargement Bath <ol class="lalpha"><li> Faire une solution de 1-2 ml de travail de la teinture. Pour Fluo-4 AM, une concentration de 5.4 uM est adéquate pour l&#39;étiquetage neuroblastes SVZ. </li><li> Les tranches sont d&#39;abord transférés à une boîte de culture de 35 mm avec un fond grillagé qui est déjà rempli avec ACSF. Remplacer la solution à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique 3 ml de transfert pour retirer doucement le ACSF, tout en ajoutant simultanément le calcium colorant la solution de travail. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30-60 min dans un groupe CO 2 5% de gaz commandé par l&#39;environnement. </li><li> Placez la tranche de retour dans la chambre ACSF remplie de tenir à laver colorant qui n&#39;a pas pénétré dans les cellules. Alternativement, on peut le placer directement sur la chambre de perfusion microscope qui exécute ACSF. Cette période de lavage est 30-45 min. </li><li> Transférer la tranche de la chambre de perfusion. </li></ol></li><li> Application d&#39;une pression de colorant <ol class="lalpha"><li> Transférer la tranche à partir de la chambre de retenue à la chambre de perfusion sur la configuration de microscope. </li><li> Remplir une pipette en verre avec une solution de travail qui est de 250 uM et le placer sur le micromanipulateur. </li><li> Abaisser la pipette de la région d&#39;intérêt. La pipette peut être placé de telle sorte que la pointe soit quelques micromètres au-dessus de la surface de tranche enterrée ou plusieurs micromètres en dessous de la surface de la tranche, mais à l&#39;écart de la région enregistrée. L&#39;angle de la pipette n&#39;a pas affect l&#39;efficacité du chargement. Quand l&#39;imagerie en dessous de la surface de la tranche, nous constatons que de placer la pointe de pipette ci-dessous le plan d&#39;imagerie va marquer notre zone d&#39;imagerie souhaité mieux. </li><li> Lorsque le colorant d&#39;application de pression, fixé au Picospritzer de sorte qu&#39;il est &lt;3 psi. Nous n&#39;avons pas estimé le volume de diffusion des colorants, parce que c&#39;est sujettes à la variabilité du diamètre pointe de la pipette, la pression appliquée, et la densité du tissu où le colorant est injecté. Nous appliquons simplement jusqu&#39;à ce que nous atteignons notre charge désirée telle qu&#39;évaluée par l&#39;œil. Minimiser les dommages à la tranche lors de l&#39;application, en particulier lorsque la pointe est placée au-dessous de la surface de la tranche. Appliquer pendant 1-2 min. Parfois, des applications répétées sont nécessaires en fonction de l&#39;étiquetage tel qu&#39;évalué par l&#39;œil. Pendant cette durée de concentration et d&#39;application, nous constatons que l&#39;application de surface de colorant qualifie de préférence neuroblastes en dessous de la surface d&#39;application étiquettes préférentiellement les astrocytes. Cependant, l&#39;application&gt; 3 min à 500 uM également étiqueter les neuroblastesindépendamment du fait que la pointe se trouve au-dessus ou en dessous de la surface de la tranche (JC Platel, observation non publiée). Permettre de lavage et de récupération tranche pendant 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Imagerie confocale de l&#39;activité de calcium <ol><li> Trouver la première région d&#39;intérêt avec un objectif à faible puissance telles que 4x ou 10x. Placez au centre du champ avant de passer à un objectif de puissance plus élevée. À ce stade, on peut évaluer la santé générale par tranche de noter l&#39;apparition de cellules SVZ en vertu contraste d&#39;interférence différentiel (DIC). Les cellules saines apparaissent rond et dodu. En outre, les cellules saines affiche faible Fluo-4 de chargement censé aucun chargement à fluorescence tout ou lumineux (une cellule de mourir). </li><li> Abaisser l&#39;objectif à immersion dans l&#39;eau sur la région d&#39;intérêt, qui est maintenant chargé de colorant. Soit un objectif 40x ou 60x a été adapté à nos besoins, bien que 40x offre un large champ de vision et permet un accès plus pipette. Quand l&#39;imagerie en dessous de lasurface, nous allons souvent au moins 15 um en dessous de la surface de la tranche où l&#39;architecture 3-dimensionnel et la santé des cellules sont mieux conservées. </li><li> Vérifiez que la perfusion et le vide sont adéquatement. </li><li> Configurez le microscope de manière à ce que la résolution time-lapse et la résolution spatiale sont mis à taux souhaités. Pour la microscopie confocale, ces facteurs doivent être soupesés par une augmentation de la résolution temporelle se traduit généralement par une perte de résolution spatiale en raison de la nature de balayage du système. Pour l&#39;activité calcique, nous avons imagé d&#39;un cadre à peu près chaque seconde avec une résolution de 512x512 pixels. Si plusieurs canaux acquises séparément sont nécessaires, cela va aussi affecter les taux d&#39;acquisition. Régler la durée de film (2-10 min). </li><li> Initier courir. Si la réalisation d&#39;études pharmacologiques, lavis sur des antagonistes ou des agonistes non désensibilisation pendant au moins 5-10 minutes, puis faire un autre film de 5-10 min. Agonistes qui peuvent désensibiliser les récepteurs peuvent être extrêmement appliquée, par exemple en utilisant un prEssure pipette contrôlée par un micromanipulateur. </li></ol> 7. Analyse de calcium Analyse suit les procédures standard que nous avons décrits dans les publications perméables 2-4. F 0 (référence exemple) et F sont les intensités moyennes de fluorescence mesurées dans l&#39;ensemble des régions d&#39;intérêt (ROI) et dans chaque ROI, respectivement. Un changement de la fluorescence a été considérée comme une augmentation de Ca 2 +, si elle était&gt; 15% F / F 0 augmentation. Intracellulaires de Ca + 2 modifications ont été calculés en utilisant Calsignal 5. 8. Les résultats représentatifs Nous avons pu obtenir chargement sélectif de cellules SVZ selon les protocoles de chargement colorant décrites ci-dessus et ailleurs 2-4,6. Chargement baignoire ou application d&#39;une pression sur la surface de la tranche de Fluo-quatre heures (4-5 ou 250 pM, respectivement) pour la plupart des étiquettes neuroblastes. Bien que l&#39;application de pression peut charger neurobdure plus rapidement que le chargement de bain en une seule tranche, le chargement bain permet le chargement simultané de plusieurs tranches. Nous confirmons l&#39;identité des cellules marquées que par les neuroblastes (1) si elles affichent un comportement migratoire 4,7, (2) leur morphologie, (3) coloration négative de sulforhodamine 101, un colorant spécifique des astrocytes-3 ou (4) une coloration positive avec DCX-DsRed expression (JC Platel, observation non publiée). Neuroblastes migrent rapidement (en moyenne 60 um / h) à température physiologique 4,7-9, mais leur mouvement peut être facilement observée même à température ambiante. Le mouvement des neuroblastes ne pose pas un problème en ce qui concerne la mise régions d&#39;intérêt (ROI) pour suivre l&#39;activité de calcium puisque nos films sont généralement de courte durée. Cependant, au cours de longues périodes d&#39;attente, comme lors des échanges de solutions de médicaments, les enquêteurs doivent faire attention à faire correspondre ROI dans le contrôle et périodes de traitement. Il n&#39;est pas rare pour les neuroblastes de migrer dans ou hors de l&#39;i<html> domaine de forgemagie ou plan focal. Application de la pression de Fluo-4 AM (250 uM) de profondeur dans la tranche et pour une durée limitée (&lt;2 min) qualifie préférentiellement les astrocytes SVZ 2. L&#39;étiquetage des astrocytes a été vérifiée par marquage positif avec sulforhodamine 101 et leur morphologie, en particulier par la présence de projections et endfeet sur ​​les vaisseaux sanguins que nous avons récemment décrits 3. En utilisant ces méthodes, nous avons observé une activité spontanée dans les deux neuroblastes SVZ et de la population d&#39;astrocytes (Figure 1). L&#39;activité dans les astrocytes prend souvent la forme d&#39;ondes qui se livrent 3 vaisseaux sanguins. En outre, en utilisant l&#39;imagerie de calcium en tant que test, l&#39;application d&#39;agonistes pharmacologiques ont révélé ou confirmé l&#39;expression des récepteurs GABA A sur les neuroblastes et les astrocytes 6, AMPA et NMDA récepteurs des neuroblastes 4. Chiffres 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Propager l&#39;activité de calcium dans les astrocytes. (A) représentant en moyenne l&#39;image d&#39;un enregistrement time-lapse de l&#39;activité de calcium. Astrocytes dans la SVZ étaient chargés de l&#39;application de la pression Fluo-quatre heures dans la tranche de profondeur. Films ont été acquises à 0,75 s temps-étapes. Régions d&#39;intérêt (ROI) sont placés sur des cellules présentant une activité. (B) Les traces de régions d&#39;intérêt placé au-dessus des cellules du film décrit en (A). Des traces ont été filtrés avec une moyenne mobile et normalisée. L&#39;échelle verticale représente 2 x AF / F 0, où F est l&#39;intensité de signal et F 0 est le signal de référence moyen et AF = 0 FF. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Figure 2. Image du système de perfusion. Une extrémité d&#39;un tube est immergé dans 95% 2 O / 5% de CO 2 gaz-perfused solution. La solution est alors perfusé à travers le tube et dans la chambre de bain par une pompe péristaltique (non représentée). L&#39;autre extrémité est insérée dans l&#39;entrée de la solution de bain de la chambre montée sur une plate-forme. Le bec d&#39;aspiration est alors reliée à la sortie de la solution de la chambre et fixé à un niveau pour déterminer la hauteur solution. À partir de la sortie, le bec d&#39;aspiration est reliée à la canalisation à vide, qui aspire la solution de la chambre dans un récipient à déchets. Le système de perfusion est mis en valeur la platine du microscope pour la clarté visuelle.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Imagerie calcique des cellules SVZ a été utilisé pour étudier les tendances de l&#39;activité spontanée dans les neuroblastes 10, l&#39;expression du récepteur de canal dans les deux neuroblastes et les astrocytes et des vagues de calcium 4,6,8 astrocytaires 3. Comme les cellules de la SVZ sont soit immatures ou ayant des propriétés gliales, ils ne se déclenche pas d&#39;action potentiels 11,12, ce qui signifie que les changements dans milliseconde potentiel de tensi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Soluté </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Dissection (mM) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissection: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mm ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Liste des produits chimiques Tableau 1. Recettes de solution dissection et ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [En-tête] </td></tr><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold ou 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue ou 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Outils de dissection </td><td> Roboz ou Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-quatre heures sensible au calcium colorant </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-une heures de calcium colorant sensible </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Solution Pluronic F-127 20% dans du DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Upright microscope confocal </td><td> Olympe </td><td> FV300 FV1000 ou </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;eau d&#39;immersion objectifs </td><td> Olympe </td><td> LUMPlanFl 40 x L / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulateurs </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> &lt;Régulateur de pression/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 psi pendant l&#39;application </td></tr><tr><td> Pipette extracteur </td><td> Sutter ou Narshige </td><td> Sutter P-97 ou Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettes en verre </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> Identification: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modèle 720 </td><td> débit: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Bain Chambre </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 BPL </td><td> Profil bas permet un dégagement objectif </td></tr><tr><td> Tubes </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Contrôleur de température </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. Matériaux / liste d&#39;équipement.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l&#39;une des deux zones neurogènes dans le cerveau postnatal. La SVZ contient des cellules très denses, y compris les cellules progénitrices neurales avec des caractéristiques astrocytaires (appelées astrocytes SVZ), neuroblastes, et les cellules progénitrices intermédiaires. Neuroblastes nés dans la SVZ tangentiellement migrer une grande distance vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en interneurones. Signalisation intercellulaires par l&#39;intermédiaire des molécules d&#39;adhésion et de signaux diffusibles jouent un rôle important dans la neurogenèse contrôle. Beaucoup de ces signaux déclencher l&#39;activité de calcium intracellulaire qui transmet l&#39;information à l&#39;intérieur et entre les cellules. L&#39;activité de calcium est donc le reflet de l&#39;activité des signaux extracellulaires et est un meilleur moyen de comprendre fonctionnelle signalisation intercellulaire entre les cellules SVZ. L&#39;activité de calcium a été étudiée dans de nombreuses autres régions et types de cellules, y compris les astrocytes et les neurones matures. Cependant, la méthode traditionnelle de loacellules d avec indicateur de calcium colorant (chargement de bain par exemple) n&#39;était pas efficace pour le chargement de tous les types de cellules SVZ. En effet, la densité cellulaire dans la SVZ empêche la diffusion de colorant dans le tissu. En outre, la préparation de coupes sagittales sera mieux préserver l&#39;agencement tridimensionnel de cellules, en particulier SVZ le flux de migration neuroblaste sur l&#39;axe rostro-caudal. Ici, nous décrivons les méthodes pour préparer des coupes sagittales contenant la SVZ, le chargement des cellules SVZ avec colorant indicateur de calcium, et de l&#39;acquisition de l&#39;activité de calcium avec time-lapse films. Nous avons utilisé Fluo-quatre heures colorant pour le chargement astrocytes SVZ l&#39;aide de l&#39;application de pression à l&#39;intérieur du tissu. L&#39;activité de calcium a été enregistrée à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage permettant une résolution précise pour distinguer les cellules individuelles. Notre approche est applicable à d&#39;autres zones neurogènes y compris la zone sous-granulaire de l&#39;hippocampe et des adultes embryonnaires zones neurogènes. En outre, d&#39;autres types de colorants peuventêtre appliqué en utilisant le procédé décrit.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Une méthode pour charger des sous-ventriculaire (SVZ zone) des cellules avec des colorants indicateurs de calcium pour l&#39;activité de calcium enregistrement est décrit. Le postnatale SVZ contient des cellules serrées y compris les cellules progénitrices neurales et neuroblastes. Plutôt que d&#39;utiliser le chargement de bain nous avons injecté le colorant par la pression à l&#39;intérieur du tissu permettant une meilleure diffusion du colorant.

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K vues.  Yale University School of Medicine. Une méthode pour charger des sous-ventriculaire (SVZ zone) des cellules avec des colorants indicateurs de calcium pour l'activité de calcium enregistrement est décrit. Le postnatale SVZ contient des cellules serrées y compris les cellules progénitrices neurales et neuroblastes. Plutôt que d'utiliser le chargement de bain nous avons injecté le colorant par la pression à l'intérieur du tissu permettant une meilleure diffusion du colorant.

Vidéo: Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

La zone sous-ventriculaire Fr-face: Coloration Wholemount et Flow épendymaire

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Recherche

Neurosciences

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Néonatale électroporation zone sous-ventriculaire

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

L&#39;incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Préparation de tranches d’hippocampe humaine aiguë pour les enregistrements électrophysiologiques

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nucléofection efficace de CSN isolées de la zone sous-ventriculaire murine

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Nucléofection améliorée pour l’administration de gènes à haute efficacité dans des cultures de cellules souches neurales dérivées de la

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...