Ce protocole fournit une base pour l’expansion des cellules tumorales qui, à son tour, permet une étude approfondie de la fonction des cellules tumorales et des états génomiques. En outre, il fournit un système modèle in vitro pour évaluer l’impact de la tumeur sur la réponse immunitaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un protocole basé sur l’établissement de lignes tumorales mésothéliales à partir du tissu du patient.
Il n’existe actuellement aucun protocole normalisé pour ce système modèle. L’aspect le plus difficile de cette technique est la présence d’une contamination par les fibroblastes dans les cultures à passage précoce. Il est essentiel d’avoir une solide compréhension des fibroblastes par rapport à la morphologie des cellules tumorales pour déterminer si les tentatives de famine des fibroblastes fonctionnent.
Commencez par transférer 10 millilitres de cocktail enzymatique de digestion tumorale dans un tube de dissociation. Transférez le morceau de tissu tumoral sur un couvercle stérile à six puits à l’aide d’un scalpel stérile. Enlevez tous les tissus nécrotiques graisseux et les caillots sanguins à l’aide d’un nouveau scalpel stérile et d’une pince.
Coupez tout le tissu tumoral en un millimètre cube de petits fragments. Pour vous assurer que le tissu ne se dessèche pas, ajoutez 500 microlitres de solution stérile de sel équilibré de Hank, ou HBSS, au tissu tumoral. Transférer des fragments tumoraux dans le tube de dissociation contenant 10 millilitres de cocktail enzymatique de digestion tumorale.
Fermez hermétiquement le tube. Placez-le côté capuchon vers le bas sur le dissociateur tissulaire et fournissez de la chaleur au dissociateur. Sélectionnez le réglage préprogrammé sur le dissociateur sur le réglage 1 du kit de dissociation de tumeur humaine de 37 degrés Celsius et vérifiez l’état après 10 minutes pour vous assurer qu’aucune erreur de colmatage n’est indiquée par la lumière rouge clignotante.
Après une heure, retirez le tube de dissociation et placez-le dans une hotte à écoulement laminaire. Filtrer la tumeur digérée en plaçant une passoire cellulaire de 70 micromètres sur un tube conique de 50 millilitres et en pipetant la tumeur digérée à l’aide d’une pipette de 10 millilitres sur le filtre. Si le filtre se bouche, passez à un nouveau filtre.
Rincez le tube de dissociation avec 10 millilitres de milieux frais de digestion tumorale et lavez à travers le filtre. Retirez et supprimez le filtre. Porter le volume total à 40 millilitres avec le milieu de digestion tumorale.
Centrifuger à 500 x g pendant cinq minutes à température ambiante. À l’aide d’une pipette d’aspiration de deux millilitres fixée à une source de vide, aspirer le surnageant sans perturber la pastille et remettre en suspension les cellules à l’aide de 10 millilitres de milieu tumoral stérile. Ensuite, encore une fois, centrifugez les tubes et aspirez le surnageant comme démontré.
Ensuite, ressuspendez les cellules dans trois millilitres de milieu tumoral stérile et transférez la suspension cellulaire dans un puits d’une plaque stérile de six puits. Gardez la plaque dans un incubateur à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, transférez le milieu utilisé de la tumeur digérée dans le premier puits vers un nouveau puits dans la même plaque de six puits, puis ajoutez trois millilitres de milieu tumoral stérile au puits un.
À l’aide d’un microscope à phase inversée, déterminez le pourcentage de contamination des fibroblastes dans la culture de passage précoce. Si la contamination par les fibroblastes est supérieure à 20% des cellules dans la culture de passage précoce, continuer la culture après avoir remplacé le milieu tumoral par le milieu sérique réduit. Si la population de fibroblastes n’est pas réduite à 10% ou moins, rincez doucement le puits avec du PBS pour éliminer le milieu contenant du sérum.
Ajouter un millilitre de trypsine par puits dans une plaque de six puits. Placez la plaque ou la fiole à six puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une minute. Retirez la plaque ou la fiole de l’incubateur et vérifiez l’adhérence des cellules à l’aide d’un microscope inversé.
Lorsque les cellules se soulèvent partiellement ou flottent, retirez doucement les cellules en suspension et la trypsine seulement. Placez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant un volume égal ou supérieur de milieu tumoral complet. Répétez la trypsinisation jusqu’à ce qu’il y ait trois à quatre fractions enlevées.
Centrifuger toutes les fractions indépendantes à 500 x g pendant cinq minutes à température ambiante. À l’aide d’une pipette d’aspiration de deux millilitres fixée à une source de vide, aspirer le surnageant sans perturber la pastille. Remettre en suspension les cellules à l’aide de cinq millilitres de milieu sérique réduit stérile.
Plaquez les cellules dans une fiole T-25 pour chaque fraction et placez les fioles dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Pour la cryoconservation des cellules à passage précoce, décongeler un tube de milieu de congélation aliquote. Prélever les cellules par trypsinisation en lavant d’abord la plaque avec du PBS et en ajoutant de la trypsine comme démontré précédemment.
Placez la fiole dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Retirez la fiole de l’incubateur et vérifiez l’adhérence des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Si les cellules se soulèvent ou flottent, retirez doucement les cellules en suspension et la trypsine.
Placez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant un volume égal ou supérieur de milieu tumoral complet. Mélanger le contenu du tube en pipetant doucement. Retirez 20 microlitres de suspension cellulaire pour le comptage.
Ensuite, centrifugez la suspension de cellule restante à 500 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Lorsque les cellules tournent, comptez à l’aide d’un protocole de comptage spécifique au laboratoire, tel que le bleu de trypan ou l’orange acridine / iodure de propidium. Remettre en suspension les cellules après centrifugation dans un milieu de congélation avec un minimum de 5 x 10 à la sixième cellule par millilitre de milieu de congélation et transférer un millilitre de cette suspension cellulaire à 1,5 millilitre de cryovial prémarqué.
Placez les cryoviales dans une chambre de congélation à vitesse contrôlée et transférez-les immédiatement à moins 80 degrés Celsius. La figure montre une augmentation de la contamination par les fibroblastes de 80% 50% et 30% par rapport à une culture sans contamination par les fibroblastes. Cette figure montre la coloration de surface de cytométrie en flux représentative de quatre lignées tumorales de mésothéliome primaire, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H et une ligne tumorale de mélanome, MEL526 comme témoin négatif.
Ces lignées cellulaires peuvent exprimer à la fois la mésothéline et la N-cadhérine. L’importance de tester l’impact du détachement enzymatique sur l’expression des marqueurs protéiques de surface est également démontrée, car la trypsine et le mélange de collagénase protéase ont entraîné la perte de l’expression de surface de la N-cadhérine, tandis que CD90 n’a pas été affecté. Les étapes importantes comprennent le traitement approprié de la tumeur, y compris l’élimination du sang et de la graisse avant la digestion, l’identification de la contamination par les fibroblastes et la détermination de la façon de limiter la prolifération des fibroblastes.
Une méthode importante suivant cette procédure comprend des tests de lymphocytes cytotoxiques pour tester la capacité des cellules T autologues à reconnaître les cellules tumorales dérivées du patient. Cette technique permettra d’identifier de nouveaux récepteurs de lymphocytes T anti-tumoraux spécifiques qui pourraient avoir une importance thérapeutique. De plus, il nous permettra d’étudier l’interaction entre la tumeur et les lymphocytes infiltrant la tumeur appariée et le dysfonctionnement immunitaire.
