Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour générer des cultures primaires de mélanocyte et de fibroblaste à partir de souris. Puisque cette technique n’exige pas que l’épiderme et le derme soient séparés, elle peut être exécutée rapidement et uniformément avec la formation minimale. Cette méthode peut être utilisée pour étudier le mélanocyte cutané et la biologie fibroblaste.
Les expériences dans ces cultures peuvent fournir des aperçus pertinents au cancer, à la cicatrisation des plaies et aux défauts de pigmentation. Avant de commencer, assurez-vous de préparer tous les reagents nécessaires et de vérifier la température du bain d’eau. Si vous prévoyez traiter plusieurs échantillons, consultez le guide de mise à l’échelle des reagents du tableau 1.
Brandon Murphy, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Dans une armoire à écoulement laminaire, rouler brièvement le tronc de chaque souris euthanasié dans une boîte de Pétri stérile contenant 70% d’éthanol. Retirer la souris de l’éthanol et la placer dans une boîte de Pétri stérile vide.
Ensuite, stérilisez les ciseaux chirurgicaux dans 70% d’éthanol. Utilisez ces ciseaux pour faire une incision dans la peau sur le côté ventral du tronc, à partir du cou et en continuant à la queue. À l’aide de forceps stériles, peler la peau du tronc de la souris et éliminer l’excès de tissu adipeux du côté cutané de la peau.
Placez la peau, côté derme vers le bas, dans un plat de six puits contenant trois millilitres de solution antimycotique antibiotique 1X. Incuber à température ambiante pendant deux à trois minutes. Ensuite, allumez l’hélico de tissu et ajustez les paramètres à ceux montrés ici.
Assurez-vous de faire preuve de prudence lors de l’installation de la lame de l’hélicoptère de tissu et lors de l’utilisation de la machine. Transférer la peau, côté derme vers le bas, dans un plat stérile chopper tissu et passer la peau complètement à travers l’hélico tissulaire trois fois. Après cela, transférer la peau homogénéisée à un tube conique stérile de 15 millilitres contenant trois millilitres de tampon de digestion de la peau.
À l’aide d’une micro-pipette P1000, mélanger vigoureusement la suspension résultante en 10 à 15 fois. Capez le tube conique et incubez l’échantillon dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en vous assurant d’inverser le tube toutes les trois à cinq minutes. Ensuite, centrifugez le tube dans un rotor balançant seau à 750 fois G à température ambiante pendant cinq minutes pour pelleter les cellules dans la peau homogénéiser.
Utilisez une micro-pipette P1000 pour enlever lentement et complètement le tampon de digestion de la peau, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Assurez-vous d’aspirer hors de toute la peau digest tampon. Si vous avez des problèmes, lavez la pastille cellulaire avec deux à trois mils de médias mélanocytes et répétez la centrifugation et retirez l’excès de tampon de digestion de la peau.
Puis résuspendez soigneusement la pastille cellulaire dans un millilitre de média mélanocyte en pipetting de haut en bas 15 à 20 fois avec une pipette P1000. Transférez la solution cellulaire résultante goutte sage à un puits non encoated dans un plat de six puits qui contient un millilitre de médias mélanocytes. Incuber l’homogénéité de la peau plaquée dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 40 minutes.
Après cela, transférer la culture supernatant du plat non cintré à un puits d’un collagène prélavé enduit six bien plat. Ajouter du G-418 aux médias, de sorte que la concentration finale est de 100 nanogrammes par millilitre. Ajouter deux millilitres de médias fibroblastes à un puits du plat non encoated contenant maintenant des fibroblastes adhérents.
Incuber les deux cultures pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après 16 à 24 heures d’incubation, aspirez séparément les médias et les débris de chaque culture. Lavez chaque plat deux fois à l’aide d’un millilitre de PBS pour chaque lavage.
Ensuite, ajoutez deux millilitres de mélanocytes frais à la culture des mélanocytes et ajoutez deux millilitres de médias fibroblastes frais à la culture fibroblaste. Dans cette étude, les cultures de fibroblaste et de mélanocyte sont simultanément générées à partir du même échantillon de peau. Lorsque la peau homogénéisée est plaquée pour la première fois, les médias semblent trouble.
Cependant, après incubation, de plus grands conglomérats cellulaires et des fibroblastes cellulaires adhérents deviennent visibles dans le plat. Les cellules non adhérentes de la culture sont transférées dans un plat enduit de collagène et traitées avec du G-418. Les fibroblastes tués par le G-418 flottent dans le milieu de culture des mélanocytes au cours des cinq prochains jours.
Après quatre à cinq jours dans la culture, les mélanocytes plaqués commencent à prendre un phénotype dendritique avec des granules melanocytic. Ce phénotype persiste lors du passage, tandis que des grappes de kératinocytes contaminants sont perdues. La pureté des cultures de mélanocyte et de fibroblaste qui en résultent est confirmée à l’aide de la cytométrie du débit.
L’expression du marqueur mélanocyte GP100 est spécifique aux cultures de mélanocytes, tandis que le marqueur fibroblaste, FSP1, se trouve uniquement dans les fibroblastes primaires. Les cellules de kératinocytes C59 de contrôle sont les seules cultures qui tachent positif pour le marqueur de kératinocyte, K14. Des analyses supplémentaires sont effectuées pour déterminer combien de temps il faut pour établir des cultures enrichies de mélanocytes.
Les cellules positives GP100 commencent à apparaître le quatrième jour et culminent après 10 jours de culture. Cette procédure peut être utilisée pour générer rapidement des cultures de mélanocytes et de fibroblastes pour une variété d’analyses omiques in vitro et à haut débit.
