Les écrans d’abandon sélectionnés CRISPR fournissent aux chercheurs une méthode simple, efficace et peu coûteuse pour interroger la fonction de la chaîne à l’échelle du génome. L’avantage de CRISPR est sa responsabilité de modifier n’importe quel gène en changeant simplement la séquence de guide. Les bibliothèques de guides CRISPR permettent aux chercheurs d’interroger l’ensemble du génome de n’importe quel organisme d’une manière impartiale et systématique.
Actuellement, des écrans CRISPR sont utilisés pour identifier les gènes essentiels à travers des centaines de cancers humains et pour cartographier les interactions génétiques. Les écrans peuvent également profiler de manière exhaustive les médicaments afin de révéler les mécanismes d’action des médicaments. Les bibliothèques CRISPR décrites ici ciblent les cellules humaines.
Toutefois, les bibliothèques de guides ciblant d’autres espèces, comme la souris, sont disponibles et peuvent faire l’objet d’un dépistage similaire. L’exécution d’écrans à l’échelle du génome dans les cellules humaines peut être intimidante dans la pratique, car elle implique la manipulation de dizaines de millions de cellules et nécessite l’analyse de grands ensembles de données. Avant de démarrer un écran, assurez-vous que les lignes cellulaires sont soigneusement caractérisées.
Cela comprend la connaissance de la pureté de votre lignée cellulaire, le doublement du temps, l’efficacité de la transduction du lentivirus et les sensibilités aux agents de sélection des antibiotiques. Une démonstration visuelle fournira une image de la façon de gérer pratiquement les millions de cellules nécessaires dans un écran et de garder une trace de milliers de perturbations d’une manière systématique. Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh et Ryan Climie, tous techniciens de mon laboratoire, démontreront la procédure.
Commencez par transformer le plasmide CRISPR sgRNA prêt à l’emploi en cellules électrocompétentes et en les cultivant selon les instructions manuscrites. Lorsqu’ils sont prêts à récolter les colonies, ajouter sept millilitres de LB avec de la carbenicilline à chaque plaque et racler les colonies avec l’épéiste cellulaire. Utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les cellules grattées dans un flacon conique stérile d’un litre, et rincez la plaque avec cinq millilitres de LB avec de la carbenicilline.
Encore une fois, transférez la solution de rinçage au flacon. Centrifugez les cellules selon les instructions manuscrites, puis déterminez le poids de la pastille humide. Purifier l’ADN plasmide à l’aide d’un kit de purification plasmide à l’échelle Maxi ou Mega.
Préparez les cellules à la transfection en ensemencement de 293 t-cells et en les incubant pendant la nuit. Le lendemain, préparer les trois mélanges de plasmides transfection pour des plaques de 15 centimètres. Calculer la quantité de plasmide nécessaire pour une transfection et faire un mélange de plasmides pour le nombre de plaques, plus une, à transfecter.
Ensuite, préparez un réagent transfection à base de lipides pour chaque transfection et un sérum à teneur réduite en tubes de microcentrifugeuses individuels de 1,5 millilitre pour que le nombre de plaques soit transfecté. Ajouter le réaccente de transfection, mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajouter de l’ADN au réaccente de transfection à un rapport de trois pour un réaccente de transfection aux microgrammes du complexe d’ADN.
Mélanger délicatement la solution et laisser à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter le mélange de transfection aux cellules d’emballage et les incuber selon les directives manuscrites. Le jour de la récolte virale, vérifiez la morphologie anormale et fusionnée des cellules comme indication d’une bonne production virale, et récoltez le lentivirus en recueillant le supernatant et en le transférant dans un tube de centrifugeuse stérile.
Commencez par sélectionner la couverture de la bibliothèque d’ARN guide CRISPR à maintenir sur l’ensemble de l’écran. Sur la base de la couverture de la bibliothèque, déterminer le nombre de cellules nécessaires pour le maintenir par ARN guide et le nombre de cellules nécessaires à l’infection à MOI 0,3. Ensuite, déterminez le nombre de plaques nécessaires à la mise en place de l’infection, puis, la récolte et la semence des cellules à chaque plaque.
Ajouter le bromure d’hexadiméthrine dans toutes les assiettes et ajouter le volume de virus requis au criblage et au contrôle de deux plaques. N’ajoutez pas de virus pour en contrôler un. Remplacez ce volume par des supports.
Bien mélanger les assiettes en s’inclinant et placer les assiettes dans un incubateur, en s’assurant qu’elles sont de niveau. Récoltez les cellules infectées selon les instructions manuscrites et recueillez trois répliques de granulés cellulaires provenant des cellules en commun pour l’extraction de l’ADN génomique. Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant cinq minutes et les laver avec PBS.
Étiquetez les tubes et séchez les granulés cellulaires à moins 80 degrés Celsius. Divisez le pool de cellules infectées en trois groupes de reproduction, en vous assurant de maintenir la couverture de la bibliothèque dans chaque réplique. Ensemencer les cellules à une densité qui serait normalement utilisée lors de leur expansion.
Utilisez le même nombre de cellules pour chaque réplique et le même nombre total de cellules entre les répliques. Continuer à passer les cellules et récolter trois répliques de granulés cellulaires à partir de chaque réplique de cellules infectées poolées pour un jusqu’à 15 à 20 doublements cellulaires. À chaque passage, récolter les cellules de toutes les plaques dans chaque réplique les uns avec les autres.
Étiquetez chaque granulé avec le temps et reproduisez la désignation. Mettre en place PCR1 selon les instructions manuscrites avec un total de 100 microgrammes d’ADN génomique à 3,5 microgrammes d’ADN génomique par réaction de 50 microlitres et mettre en place des réactions identiques de 50 microlitres pour atteindre la couverture souhaitée. Configurer une réaction de tube PCR selon les instructions manuscrites.
Utilisez cinq microlitres du produit PCR1 mis en commun comme modèle et utilisez des combinaisons uniques d’amorces d’index pour chaque échantillon individuel afin de permettre la mise en commun d’échantillons de bibliothèque de séquençage. Après avoir terminé le PCR, exécutez le produit de tube de PCR sur un gel d’agarose de 2% à basse tension pendant une à 1 1/2 heures. Visualisez le produit sur un transilluminateur à lumière bleue et excisez la bande de paires de base de 200.
Purifier l’ADN et mesurer sa quantité et sa qualité à la fois avec un spectrophotomètre et un fluoromètre. Une bibliothèque d’ARN guide idéal devrait avoir chaque ARN guide unique représenté à des quantités similaires. Le séquençage de prochaine génération peut être utilisé pour confirmer que la bibliothèque a une distribution serrée des ARN guides.
L’analyse de précision-rappel peut être utilisée pour évaluer les performances de l’écran. Un écran performant devrait récupérer un grand nombre de gènes essentiels à un facteur de base supérieur à six et un faux taux de découverte inférieur à 5 %La courbe de rappel de précision devrait avoir un coude pointu et une ligne droite jusqu’au point terminal. Le facteur Bayes représente une mesure de confiance que le gène KNOCKOUT entraîne un défaut de forme physique.
Des scores élevés indiquent une confiance accrue, tandis que de faibles scores suggèrent que le gène KNOCKOUT offre des avantages de croissance. Les piscines à élimination directe à l’échelle du génome peuvent être cultivés en présence d’un agent médicamentaire excédentaire pour rechercher des gènes de résistance suppresseur. Pour effectuer un écran de sélection positif pour suppresseur de bloc de thymidine, les comptes de lecture normalisés pour tous les ARN guides à T0 sont tracés en fonction des comptes de lecture moyennement normalisés pour les échantillons traités à la thymidine.
Un détail clé pour effectuer avec succès des écrans CRISPR est de maintenir une bonne distribution de chaque ARN guide, à partir de la transfection du plasmide à la transduction des cellules. Cela permettra de minimiser les risques d’effets aléatoires qui peuvent fausser la représentation de l’ARN guide et conduire à de faux résultats positifs ou négatifs. Après une validation d’écran, des expériences doivent être faites pour confirmer les coups parce que l’écran principal n’identifie que les coups potentiels.
Selon la biologie des coups, diverses méthodes peuvent être utilisées. L’édition CRISPR, combinée au séquençage de prochaine génération, a permis la perte à l’échelle du génome d’écrans de fonction dans divers systèmes de modèles humains. En raison de la simplicité de CRISPR, ces types d’écrans sont maintenant largement accessibles à tous les chercheurs, permettant à un plus grand nombre de scientifiques d’utiliser des méthodes génétiques fonctionnelles pour étudier les processus biologiques et les maladies.
