Notre sgRNA mis en commun appelé le dépistage de la bibliothèque, est une approche génétique puissante pour identifier et évaluer la fonction biologique des éléments non codants dans tout le génome. Cette technique nous permet d’examiner l’effet de la perturbation des sites de liaison associés, des limites chromatiques ou d’autres éléments réglementaires sur l’expression ciblée des gènes. Notre approche peut être utilisée pour identifier le rôle du CTCF, des ARN et des exhausteurs longs non codants, dans la régulation du gène HOX dans le développement embryonnaire précoce, ainsi que certaines leucémies avec une signature aberrante de gène HOX.
Commencez cette procédure par la conception d’un sgRNA ciblant les sites de liaison CTCF. Clonage de la bibliothèque sgRNA dans la préparation cellulaire tel que décrit dans le protocole de texte. Pour emballer le lentivirus, cotransfect cellules T HEK293 avec 20 microgrammes de vecteurs de bibliothèque purifiés, 15 microgrammes du plasmide emballé, et 10 microgrammes de l’enveloppe plasmide, pendant 48 heures avant la récolte des virus.
Après 48 heures, recueillir le virus supernatant et le filtrer à travers une membrane PVDF liant à faible teneur en protéines de 0,45 micron. Ensuite, concentrez le supernatant lentiviral par 50 fois, à l’aide du concentrateur. Aliquot les virus concentrés et les stocker dans un congélateur moins 80 degrés Celsius.
Travailler dans des puits séparés d’une plaque de puits de 12 puits pour mélanger les cellules MOLM13 avec diverses doses du lentivirus concentré pour six groupes totaux. Centrifugez immédiatement ces mélanges à 1000 fois g pendant deux heures à 33 degrés Celsius. Transférez les 12 plaques de puits à l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures.
Aspirez doucement le supernatant sans déranger la palette cellulaire, et suspendez les cellules transduites avec le RPMI 1640 Medium fraîchement complété. Ensuite, transférez les cellules re-suspendues aux flacons T25 et incubez à 37 degrés Celsius pendant 48 heures sans puromycine. Après 48 heures, ces cellules se sont divisées en deux flacons, un groupe expérimental traité avec un microlitre par puromycine millilitre pendant cinq jours, et un groupe témoin sans traitement par puromycine pendant cinq jours.
Mesurer la valeur moi optimisée pour la transduction en divisant le nombre de cellules vivantes traitées à la puromycine par le nombre de cellules sans traitement à la puromycine. Pour transduire les cellules avec la bibliothèque mise en commun, infecter 1,5 million de cellules MOLM13 dans une plaque de puits de 6 avec 0,3 MOI de lentivirus mis en commun sgRNA en milieu. Utilisez les cellules sans l’infection à lentivirus comme un contrôle.
Centrifugez immédiatement la plaque de six puits à 1000 fois g pendant deux heures à 33 degrés Celsius pour faire tourner les cellules. Ensuite, transférez les plaques à l’incubateur à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant quatre heures. Aspirez doucement le surnatant sans perturber la palette cellulaire et suspendez les cellules transduced avec un milieu frais.
Ensuite, transférez les cellules dans des flacons T25 et incubez à 37 degrés Celsius pendant 48 heures sans puromycine. Après 48 heures, traiter les cellules avec un microgramme par puromycine millilitre pendant cinq jours. Échangez contre un milieu frais après deux jours et maintenez une densité cellulaire optimale.
Ensemencer le clone unique dans 96 plaques de puits avec des méthodes de dilution limitantes. Incuber ces clones simples à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Culturez-les pendant 3-4 semaines.
Comptez les cellules MOLM13 intégrées sgRNA avec 0,4% de coloration de solution Trypan Blue, puis transférez 10 000 cellules vivantes par puits à une plaque PCR bien 96. Centrifuger la plaque à 1000 fois g pendant cinq minutes, puis retirer et jeter soigneusement le supernatant à l’avec une pipette. Évitez de déranger la palette cellulaire.
Après avoir lavé les cellules comme décrit dans le texte ajouter 50 microlitres de la lyse cellulaire master mix à chaque puits. Pipette de haut en bas cinq fois pour suspendre à nouveau la palette cellulaire. Incuber le mélange pendant 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, transférez le mélange à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires. Maintenant, ajoutez un microlitre de lysate cellulaire aux puits PCR contenant le mélange de réaction RT qPCR. Ce mélange inclut les gènes marqueurs vers l’avant et l’amorce inverse, la transcriptase inverse et le mélange de réactions one-step.
Exécutez la réaction de transcription inverse pendant 10 minutes à 50 degrés Celsius suivie de l’activation de polymérisation, et de l’ADN-dénaturation pendant une minute à 95 degrés Celsius. Effectuez rt PCR avec 40 cycles de réaction PCR tels que détaillés dans le protocole de texte. Vérifiez la diminution des clones d’expression HOXA9 par séquençage Sanger et effectuez pcr avec l’ADN du génome MOLM13 tel que décrit dans le protocole de texte.
Extraire et purifier les produits PCR avec le kit de purification PCR. Ligate les produits PCR purifiés dans le vecteur T avec tampon de ligature T4, ADN vecteur T, ADN PCR et ligase T4. Placer le mélange de ligature dans un incubateur à 16 degrés Celsius pendant la nuit.
Transférer le mélange de ligature dans les cellules dh5 alpha compétentes et plaque sur une plaque d’agar antibiotique ampicilline LB. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Choisissez les clones simples de la plaque LB et vérifiez-les par génotypage et séquençage Sanger.
Mettre en place le groupe de mélange hétéroduplex avec 200 nanogrammes de la référence, et 200 nanogrammes d’amplicons PCR d’essai dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Inclure le groupe de mélange homoduplex avec seulement 400 nanogrammes d’amplicons PCR de référence comme un contrôle. Incubez séparément le mélange hétéroduplexe et homoduplex à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un bécher d’un litre rempli de 800 millilitres d’eau.
Ensuite, refroidissez graduellement les mélanges à température ambiante jusqu’à anneal et formez l’hétéroduplexe ou l’homoduplex. Maintenant, digérer séparément 400 nanogrammes du mélange annealed hétéroduplex et homoduplex avec un microlitre de nucléase de détection de mutation indélébile, et deux microlitres de tampon de réaction de nucléase à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes. Analyser les échantillons digérés avec l’électrophoresis de gel d’agarose.
L’ADN du mélange hétéroduplexe doit être coupé en petits fragments et l’ADN homoduplex ne doit pas être coupé. sgRNA ciblant molm13 clones positifs ont été confirmés avec la méthode RT qPCR, basé sur les niveaux d’expression des gènes HOXA9 avec la comparaison avec les cellules de contrôle. Sur les 528 clones survivants examinés, 10 clones présentaient une réduction de plus de 50 % des niveaux hoxa9.
sgRNAs intégrés dans le HOXA9 réduit, HOXA9 inchangé et HOXA9 clones accrus, ont été confirmés par l’amplification pcr de la sgRNA et l’identification par la séquence Sanger. Six clones sur dix présentant une réduction des niveaux hoxa9 contenaient des SGARN ciblant le site CBS79, tel que déterminé par le séquençage sanger. Des mutations indélébiles des clones positifs intégrés de sgRNA ont été déterminées par la digestion de génotypage et de nucléase basée sur PCR.
La suppression hétérozygote du site CTCF situé entre les gènes HOXA7 et HOXA9 a été identifiée par génotypage basé sur pcr. Hoxa9-diminué clones cinq, six, 28 et 121 ont montré la suppression dans l’emplacement de frontière CBS79. Des résultats similaires ont été observés pour les mutations indélébiles dans le site CBS79 qui ont été analysées par l’analyse de digestion de nucléase.
Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de faire des quantités égales d’hétéroduplexes et d’homoduplexes afin de détecter les mutations indélébiles induites par sgRNA par l’essai de digestion de nucléase. Notre approche permet l’utilisation du marqueur sélectionné, d’effectuer le séquençage de prochaine génération sur le gène cible pour découvrir les effets du gène sur la leukemogenèse. Dans l’ensemble, notre approche empêche rpc pour le correct fonctionnel et la réduction d’un élément génétique irrégulier noté au cours du processus biologique normal et la leukemogenèse dans l’erreur posthume projet du génome.
