Ce protocole permet la reconstruction 3D d’organites de manière simple et robuste, tout en étant accessible aux laboratoires qui ne disposent pas actuellement de microscopes électroniques de volume spécialisés. Cette technique est extrêmement flexible, offrant une excellente résolution X / Y, tout en pouvant ré-imager des échantillons si nécessaire. Il est également compatible avec la tomographie inclinable lorsque la très haute résolution Z est requise.
Cette technique permet d’interroger la morphologie des organites dans un contexte inter-organites. Par conséquent, il peut être étendu pour examiner toutes les conditions pathologiques avec des défauts organites. Cette approche peut fournir un aperçu des interactions entre les organites et les événements de trafic cellulaire.
Cette méthode peut également être appliquée à d’autres tissus, modèles organoïdes et systèmes de culture cellulaire, en plus des hépatocytes. Les nouveaux utilisateurs peuvent trouver le sectionnement en série et le ramassage difficiles sans perte. Il est recommandé d’être compétent dans la section ultra-mince régulière avant d’appliquer ce protocole à un échantillon précieux.
Commencez par couper soigneusement le tissu incorporé dans la résine à l’aide d’une lame de rasoir avec l’échantillon verrouillé dans l’adaptateur de coupe. Transférez l’arche de spécimen avec le mandrin et l’échantillon dans le bras d’échantillon du microtome et positionnez l’arche de spécimen de sorte que la plage de déplacement de l’arche s’étende de haut en bas. Placez et verrouillez le couteau à diamant dans le porte-couteau, en vous assurant que l’angle de coupe du couteau est réglé de manière appropriée.
Verrouillez le porte-couteau dans la scène en toute sécurité. Éteignez le downlighting de la scène, allumez l’éclairage de la scène, déplacez prudemment le couteau vers l’échantillon, en ajustant continuellement l’angle latéral, l’inclinaison de l’échantillon et la rotation de l’échantillon du couteau en ajustant les boutons pertinents jusqu’à ce que la face du bloc soit alignée sur le bord du couteau. Placez le haut et le bas de la fenêtre de coupe du bras de l’échantillon et laissez l’échantillon juste en dessous du bord du couteau.
Remplissez le bateau à couteaux avec de l’eau propre et double distillée et assurez-vous que la surface de l’eau est au niveau du bord du couteau et légèrement concave. Ensuite, commencez à couper des sections. Arrêtez la coupe juste après que l’échantillon a passé le bord du couteau.
Utilisez une grille d’emplacement vide pour estimer le nombre de sections à collecter sur chaque grille. À l’aide d’un cil dans chaque main, divisez doucement le ruban en rubans plus petits qui peuvent tenir dans la longueur de la grille de fente. Notez mentalement leur position relative au sein de l’échantillon.
À l’aide d’une tige applicatrice en verre, faites glisser une goutte de chloroforme sur les sections pour les aplatir. Prenez la première grille de fente vide avec les premières pinces numérotées et trempez-la doucement dans le Triton X-100, puis deux fois dans l’eau distillée. Utilisez un morceau de papier filtre pour éliminer l’excès d’eau du bord de la pince.
À l’aide d’une pince, abaissez doucement environ les 2/3 de la grille de fente recouverte de formvar dans l’eau du bateau à couteaux. Assurez-vous que le côté formvar est orienté vers le bas et que le long bord droit de la fente est à la surface de l’eau et parallèle au bord de l’eau. Agitez doucement la grille dans l’eau vers les rubans de sorte qu’au coup de retour, les sections dérivent vers la grille.
Continuez à le faire dans des wafts de plus en plus petits, jusqu’à ce que le bord droit du ruban s’aligne avec le bord droit de la fente. Ensuite, avec la dernière vague, amenez doucement la grille vers le haut pour ramasser les sections dans la grille de fente. Placez plusieurs pastilles d’hydroxyde de sodium sous le couvercle d’une boîte de Pétri pour fournir un environnement sans dioxyde de carbone.
Ensuite, pipettez soigneusement 40 microlitres de citrate de plomb de Reynold sur le parafilm, une goutte pour chaque grille. Inverser chaque grille sur la goutte de citrate de plomb et laisser protégé par le couvercle de la boîte de Petri pendant 7 à 10 minutes. Pendant que les grilles se tachent, placez cinq gouttes d’eau distillée d’environ 300 microlitres pour chaque grille sur le parafilm.
À la fin de l’incubation du citrate de plomb, transférer chaque grille dans une gouttelette d’eau distillée pour la laver pendant une minute sans respirer directement sur les grilles. Répétez cette opération quatre fois de plus. Utilisez des pinces croisées numérotées pour ramasser la première grille.
Touchez le bord de la grille pour filtrer le papier afin d’évacuer la majeure partie de l’eau et laissez sécher dans les pinces pendant au moins 20 minutes. Répétez cette opération pour chaque grille. À faible grossissement, observez l’ordre, l’emplacement et la position des sections série.
Accédez à la section centrale de la série sur la grille. Parcourez l’échantillon et identifiez une région d’intérêt. Ensuite, observez l’échantillon au grossissement souhaité.
Envisagez de collecter la série à un grossissement légèrement inférieur, car les sections ne sont souvent pas parfaitement alignées et les images peuvent devoir être recadrées plus tard. Ensuite, prenez des images de référence à des grossissements plus faibles. Cela aidera à apprécier le contexte de la région d’intérêt, son emplacement approximatif à différents grossissements par rapport aux limites de section et les caractéristiques de repère dans l’échantillon.
Utilisez-les pour indiquer la région d’intérêt dans d’autres sections. Pour le référencement à l’écran, utilisez du mastic adhésif réutilisable, des autocollants ou un morceau de papier de rétroprojecteur collé à l’écran pour placer des marqueurs temporaires sur l’écran. Cela permettra de réimaginer en routine les mêmes caractéristiques de la région d’intérêt au centre de l’image dans l’ensemble de données.
Ouvrez la pile d’images, spécifiez les mesures voxel et sélectionnez l’onglet Segmentation pour lancer la segmentation. Cliquez sur Nouveau dans le panneau de l’éditeur de segmentation pour définir de nouveaux objets dans la liste des matériaux. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour modifier la couleur de l’objet et double-cliquez pour renommer l’objet.
Pour la segmentation manuelle, choisissez l’outil de segmentation sous la liste des matériaux et sélectionnez l’outil de pinceau par défaut pour mettre en surbrillance les pixels. L’image en microscopie électronique de deux hépatocytes opposés est montrée ici. L’imagerie à grossissement plus élevé permet l’observation des détails morphologiques des différents organites avec une résolution nanométrique.
L’image représentative montre la version segmentée du même tomogramme, la trace du réticulum endoplasmique, les mitochondries et les contacts intermembranaires entre l’ER et les mitochondries de différents espaces sont montrés ici. L’image représentative montre une ortho-tranche inclinée recouverte de traces de segmentation et de sa position relative dans l’ensemble de la mitochondrie. La reconstruction 3D des organites segmentés et des contacts endoplasmiques réticulum-mitochondries sous différents angles est montrée ici.
Comme ce protocole est compatible avec la tomographie par inclinaison lorsque la résolution Z très élevée est nécessaire, il aide à résoudre les structures petites ou alambiquées. Cette technique est parfaite pour l’évaluation initiale de la relation spatiale entre différents organites et, par conséquent, particulièrement utile dans le domaine en progression des contacts membranaires à l’homéostasie membranaire.
