Ce protocole compare la charge de plaque bêta-amyloïde dans des sections complètes d’intérêt et des sous-régions d’intérêt dans des sections cérébrales de souris transgéniques APP / PS1. La méthode et les résultats présentés dans ce protocole particulier permettront aux lecteurs ou aux chercheurs de choisir entre l’analyse complète de la région d’intérêt ou de la sous-région d’intérêt pour déterminer une charge bêta dans les sections du cerveau de souris. Pour commencer, téléchargez le logiciel d’analyse d’images.
Lors de l’installation, démarrez le logiciel et cliquez sur le fichier, puis ouvrez et choisissez l’image à analyser. Dans la barre d’outils du logiciel, sélectionnez l’outil droit et tracez une ligne droite le long de la barre d’échelle. Cliquez sur l’analyse, puis cliquez sur les onglets d’échelle définis.
Encore une fois, cliquez sur l’analyse, puis mesurez les onglets pour noter la longueur ou la distance de la barre d’échelle en pixels. Dans la fenêtre contextuelle, entrez la distance en pixels, la distance connue de la barre d’échelle et entrez l’unité de longueur sous forme de micromètre. Ensuite, cochez la case globale pour appliquer le nouveau paramètre d’échelle à toutes les images suivantes, si plusieurs images sont traitées.
Cliquez sur OK pour appliquer les paramètres. Pour définir la mesure souhaitée sur la zone de la section, accédez à Analyser, puis définissez les mesures, puis sélectionnez la zone et affichez les zones d’étiquette. Assurez-vous que l’image analysée est sélectionnée sous l’onglet Rediriger vers.
Pour faciliter la visualisation de l’hippocampe ou du cortex, accédez à l’image et ajustez la luminosité ou le contraste. Faites glisser la barre de glissement maximale progressivement vers la gauche pour augmenter la clarté des tissus jusqu’à ce que les régions cérébrales d’intérêt ou de retour sur investissement soient identifiables. Utilisez l’outil de sélection de polygones ou à main levée pour décrire la région de l’hippocampe.
Une fois la région définie, cliquez sur l’option de réinitialisation des paramètres de luminosité ou de contraste pour revenir à la luminosité d’origine. Pour mesurer la surface totale des tissus de la région sélectionnée, cliquez sur l’option Modifier et effacer à l’extérieur. Une fois que la région sélectionnée est la seule image à l’écran, cliquez sur l’analyse, puis sur les onglets de mesure pour obtenir la surface totale du tissu analysée dans une fenêtre contextuelle.
Ensuite, enregistrez les données dans un fichier Excel. Pour mesurer la zone positive colorée 6-E10, accédez aux onglets Image, Ajuster et Seuil de couleur dans l’ordre. Un filtre préfabriqué sous la méthode de seuillage fournit les résultats souhaités mettant en évidence les signaux les plus forts en rouge.
Après avoir sélectionné le seuil approprié, vérifiez le fond sombre pour mettre en évidence les taches bêta amyloïdes sur un fond noir. Cliquez sur la sélection, puis sur l’original, puis sur la sélection, en donnant les signaux sombres des dépôts bêta-amyloïdes sur fond blanc. Lorsque la fenêtre contextuelle génère, cliquez sur l’onglet Analyser et analyser les particules, puis appuyez sur OK. Copiez la sortie récapitulative générée par le logiciel en cliquant sur les boutons Modifier et Copier.
Ensuite, collez dans le fichier Excel précédemment démarré avec les étiquettes respectives. Calculez le pourcentage de zone positive 6E-10 à l’aide de la formule Après avoir téléchargé le logiciel d’analyse d’images, effectuez les étapes jusqu’à ce que le retour sur investissement du cerveau soit identifiable, comme démontré précédemment. Ensuite, à l’aide de l’outil rectangle, sélectionnez le retour sur investissement dans le cortex ou l’hippocampe.
Dans la barre d’outils, cliquez sur modifier, puis sur sélectionner et spécifiez l’onglet en changeant la hauteur et la largeur en une valeur prédéfinie. Ajustez la boîte pour qu’elle soit entièrement recouverte par le tissu. Réinitialisez la luminosité ou le contraste à la luminosité d’origine.
Dupliquez le retour sur investissement sélectionné en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la case et en cliquant sur le duplicata. Une nouvelle fenêtre avec la région sélectionnée s’ouvrira. Renommez l’image dupliquée pour afficher la région dans laquelle elle se trouve.
Ajustez le type d’image dupliquée en utilisant la barre d’outils et en cliquant sur l’image, puis tapez des touches 8 bits pour convertir l’image RVB dupliquée en 8 bits, afin d’analyser au mieux les plaques. Inversez l’image en cliquant sur modifier, puis inverser. Pour mesurer la zone positive 6E-10, accédez à l’image, puis ajustez et seuilz.
Un filtre prédéfini sous la méthode de seuil fournira les résultats souhaités, en mettant en évidence les signaux les plus forts en rouge. Après avoir sélectionné le seuil approprié, appuyez sur Appliquer. Pour analyser la zone positive 6E-10, utilisez la barre d’outils et cliquez sur les onglets Analyser et analyser les particules, en vous assurant que les résultats résumés sont vérifiés.
Copiez la sortie du résumé avec la zone de pourcentage en cliquant sur les onglets Modifier et Copier. Ensuite, collez la sortie récapitulative dans le fichier Excel précédemment démarré avec les étiquettes respectives. Répétez la procédure pour les différentes régions du tissu, en vous assurant que le placement de chaque boîte pour décrire le retour sur investissement est cohérent entre chaque image.
Dans cette évaluation représentative, des méthodes d’analyse du retour sur investissement complet et sub sont comparées pour quantifier la zone positive 6E-10 dans le cortex et les tissus cérébraux de l’hippocampe. L’analyse complète du retour sur investissement implique de décrire l’ensemble du retour sur investissement. En revanche, l’analyse du sous-retour sur investissement implique la sélection d’une région prédéfinie dans le retour sur investissement.
La procédure par étapes pour la quantification de la zone positive DU ROI 6E-10 complet et inférieur, avec rotation du retour sur investissement pour la quantification du sous-retour sur investissement, est présentée ici. La corrélation entre les analyses du retour sur investissement complet et inférieur est démontrée ici. Une corrélation positive significative a été observée entre la zone positive 6E-10 rapportée par les deux lecteurs effectuant l’analyse sub ROI pour le cortex et l’hippocampe.
En outre, la zone positive moyenne inférieure au ROI 6E-10 partageait une corrélation positive forte et significative avec la zone obtenue en utilisant le retour sur investissement complet. Pour la zone positive moyenne de 6E-10 dans l’ensemble dans les analyses de sous-retour sur investissement, aucune différence significative n’a été observée dans le cortex et l’hippocampe. Une corrélation significative a été observée entre les mesures de l’homogénat du cerveau entier et de la bêta-amyloïde soluble 1-42, par Eliza, et l’analyse complète du retour sur investissement de l’étude La sélection du seuil est essentielle pour obtenir une quantification précise des données.
L’intervention de l’utilisateur est nécessaire pour s’assurer que les taches positives sont sélectionnées avec précision avec le filtre sélectionné. Outre la quantification de la bêta-amyloïde, cette méthode peut être utilisée pour d’autres immuno-colorations fluorescentes. Par exemple, Iba-1, à partir de la quantification de la surface positive microgliale.
