Le protocole présente comment la combinaison de TEM de cellule liquide et d’éclairage lumineux peut être utilisée pour observer les changements structurels dans les bactéries encapsulées avec un photosensibilisateur lors de l’éclairage lumineux. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité. Le protocole ne nécessite pas de préparation d’échantillon difficile et fournit une encapsulation suffisante des bactéries avec une solution photosensibilisante.
Pour commencer, modifiez le microscope électronique à transmission en connectant la fibre optique à la colonne du microscope au sommet de la lentille de l’objectif. Prévoyez quelques centimètres d’espace entre l’objectif et la lentille du condensateur, ainsi qu’un emplacement libre pour les accessoires. Placer deux grilles TEM non traitées recouvertes de carbone amorphe entre deux pinces croisées, face au côté recouvert de carbone vers le haut.
Tenez les grilles aussi près du bord que possible. Mettez quatre microlitres de solution bactérienne sur l’une des grilles. La densité optique de l’échantillon doit être comprise entre cinq et 10.
Attendez 60 secondes et épongez soigneusement le liquide à l’aide de papier filtre. Essayez de répandre le liquide sur toute la surface de la grille pendant le processus. Mettez quatre microlitres de photosensibilisateur sur la même grille.
Après cinq secondes, effacez le liquide. Laissez une très fine couche de liquide sur le substrat. Placez rapidement la grille sèche sur celle recouverte de liquide.
Déplacez doucement la grille supérieure vers le bord de la seconde et pressez les substrats sur les bords à l’aide d’une pince à épiler. Répétez soigneusement la pression. Laissez la cellule liquide entre les pincettes pendant une minute.
Insérez l’échantillon dans le support TEM juste après avoir terminé la préparation. Après avoir inséré l’échantillon dans le microscope, commencez les observations en mode de faible grossissement pour trouver une zone d’observation appropriée. Pendant les observations, maintenez la dose d’électrons aussi faible que possible.
Augmentez le temps d’exposition. Trouvez les cellules entourées de liquide au grossissement approprié avec un temps d’exposition prolongé et capturez immédiatement la première image. Maintenez la dose d’électrons constante et collectez des images toutes les 30 secondes pour observer les changements.
Examinez attentivement les images et calculez la dose totale d’électrons qui correspond aux premiers changements visibles dans les cellules. Avant de commencer l’expérience, réglez l’intensité de la lumière laser en ajustant la valeur actuelle. Insérez l’échantillon dans le microscope et trouvez la zone d’observation.
Capturez la première image de la cellule avant de commencer l’éclairage de l’échantillon et utilisez l’occulteur de faisceau pour éteindre le faisceau d’électrons afin d’éviter les effets de l’irradiation électronique. Allumez le laser. Commencez par un temps d’éclairage court, car la lumière laser a une intensité relativement élevée.
Après ce temps, éteignez la source lumineuse. Éteignez l’occulteur de faisceau et capturez l’image immédiatement. Si possible, utilisez un algorithme automatique pour exposer l’échantillon uniquement pendant le temps nécessaire à la prise de l’image.
Mesurer soigneusement le temps d’irradiation électronique pour calculer la dose d’électrons utilisée pour l’imagerie. Une dégradation notable de la couche externe de la cellule causée par les espèces réactives de l’oxygène générées par un rayonnement plus léger du photosensibilisateur après une minute est observée. Un éclairage lumineux supplémentaire a rendu les changements plus visibles.
Des points d’observation appropriés avec suffisamment de liquide peuvent être facilement trouvés à faible grossissement, car ces zones apparaissent plus sombres et floues. Les bactéries couvertes de liquide sont moins visibles que les bactéries sèches, mais peuvent toujours être distinguées. Il est utile de regarder la limite du liquide pendant l’imagerie, et son mouvement peut être facilement détecté, ce qui implique que la zone choisie peut être inappropriée et instable.
Un autre problème lors des observations est l’évaporation de l’eau et la précipitation de la solution qui peuvent se produire dans des zones aléatoires de l’échantillon, y compris les zones entourant les bactéries. L’encapsulation de bactéries peut également être réalisée à l’aide de membranes de graphène et de nitrate de silicium. La préparation de l’échantillon est plus difficile, mais la stabilité de la cellule liquide sera meilleure.
La méthode présentée peut être utilisée pour l’observation de réactions induites par la lumière sur un liquide. Par exemple, l’influence de la lumière sur les matériaux métalliques, les catalyseurs induits par la lumière et les réactions photochimiques.
