Ce protocole est conçu pour vérifier si un candidat composé anti-VHB inhibe l’entrée virale, en particulier en bloquant la liaison au PNCP. Cette technique vise à déterminer si l’entrée du VHB ou une étape initiale de l’infection pourrait être interrompue par un composé candidat. La démonstration de la procédure sera Piyanoot Thongsri, un étudiant PSP de mon laboratoire.
Pour commencer la mesure du polypeptide co-transportant du taurocholate de sodium, ou NTCP, incuber les hépatocytes matures avec huit moulins ou plus d’acide éthylènediaminetétraacétique ou EDTA pendant 15 minutes. Recueillir les granulés cellulaires et fixer les hépatocytes en ajoutant 300 microlitres de paraformaldéhyde à 3,7% dans du PBS pendant 15 minutes. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour les centrifuger à 300 G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Lavez les cellules deux fois en utilisant 700 microlitres de PBS contenant 1% de sérum bovin fœtal ou FBS dans une centrifugeuse pendant 10 minutes comme décrit précédemment. Perméabilisez ensuite les cellules avec 300 microlitres de 0,05% de Triton X 100 dans du PBS à température ambiante pendant 20 minutes. Après la centrifugation, donnez trois lavages d’une minute chacun en utilisant 700 microlitres de PBS contenant 1% FBS.
Incuber les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec l’anticorps primaire contre le PNCP dans un rapport de un à 100, suivi de trois lavages avec tampon de lavage permanent et d’une centrifugation. Colorer les cellules avec un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et répéter trois lavages de tampon de lavage permanent pendant une minute chacun. Après centrifugation à 300 G, remettre en suspension la pastille de la cellule avec 200 microlitres de PBS contenant 1% de FBS.
Dans le logiciel, sélectionnez les paramètres de mesure pour l’analyse cytométrique en flux, y compris FSC, SSC, FITC ou PE. Définissez l’ajustement automatique de la compensation et incluez les contrôles de compensation comme expliqué dans le manuscrit. Ensuite, exécutez l’échantillon non coloré avec un débit fluidique moyen de 60 microlitres par minute. Ajustez le seuil de diffusion vers l’avant et le seuil de diffusion latérale jusqu’à ce qu’ils couvrent la population cellulaire d’intérêt.
Marquez la zone de la porte dans cette zone et appliquez-la à tous les contrôles de compensation. Réglez le tube photomultiplicateur ou la fluorescence PMT à l’aide de la commande non colorée et ajustez la tension PMT de FITC ou PE dans le quadrant négatif. Exécutez l’échantillon coloré positif et ajustez FITC ou PE dans l’échelle du quadrant positif.
Exécutez les contrôles non tachés, FITC colorés ou PE, calculez la compensation et appliquez-la aux paramètres de l’échantillon. Ensuite, exécutez l’échantillon d’hépatocytes pour mesurer le niveau NTCP. Ensuite, commencez à analyser les hépatocytes colorés en sélectionnant en série sur les fenêtres BD FACSuite, le tube de contrôle, puis l’onglet Sources de données.
Attendez que les données brutes apparaissent. Ensuite, dans l’onglet de la feuille de calcul sur le côté droit, cliquez sur le bouton de porte d’ellipse, sélectionnez la population de cellules et SSC et le diagramme à points FSC à l’aide du curseur de la souris. Attendez ensuite que le cercle P1 apparaisse.
Cliquez sur le bouton de porte d’intervalle et marquez la région dans l’histogramme coloré à l’isothiocyanate de fluorescéine. En partant de la valeur d’intensité de fluorescence la plus élevée vers le côté droit. La ligne P2 apparaît à l’écran.
Cliquez sur le tube d’expérience et observez que les données de l’onglet de la feuille de calcul changent. Cliquez sur le bouton des statistiques, puis sur l’espace vide et la feuille de calcul. Ensuite, observez les valeurs statistiques de la population de polypeptides co-transportant du taurocholate de sodium.
Aspirer le milieu des plaques de puits CMH confluentes à 100% et ajouter quatre micromolaires cyclosporine A diluées avec le milieu E de William pendant deux heures. Ensuite, aspirez le candidat inhibiteur d’entrée du virus de l’hépatite B pour le remplacer par un millilitre de Williams E Medium contenant 4% de polyéthylène glycol. Ensuite, incuber le milieu de culture avec des particules du virus de l’hépatite B à une multiplicité d’infection de 100 par puits pendant 18 heures à 37 degrés Celsius.
Ensuite, jetez le surnageant à deux millilitres de PBS froid et agitez doucement pour rincer l’ancien milieu avec le virus de l’hépatite B non lié. Après avoir cultivé les cellules avec deux millilitres de milieu E complet de William pendant sept jours, lavez les cellules avec du PBS et fixez-les avec de l’aldéhyde paraforme à 3,7% et du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Incuber séquentiellement les cellules infectées avec une solution de blocage de l’IF pendant 60 minutes à température ambiante dans l’anticorps primaire à une dilution de un à 200 dans la solution de blocage pendant une nuit à quatre degrés Celsius.
Ensuite, administrer trois lavages d’une minute chacun à l’aide d’une solution de lavage avant d’incuber les cellules avec l’anticorps secondaire en une dilution à 500 pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé trois fois, montez l’échantillon avec un support de montage anti-décoloration avec DAPI et recouvrez-le d’un couvercle en verre. L’utilisation d’un microscope à fluorescence équipé de filtres DAPI et PE détecte le signal de fluorescence avec une lentille d’objectif 20 x pour déterminer l’activité d’entrée anti-VHB des composés candidats.
Pour le test de liaison cellulaire, préparez les cellules comme démontré précédemment et incuberez-les avec des particules du virus de l’hépatite B à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Après avoir jeté le milieu, rincer les cellules avec deux millilitres de PBS froid avec un léger tourbillon. Ensuite, récoltez les cellules infectées à l’aide d’un grattoir cellulaire et perturbez les cellules avec un tampon de lyse.
Transférer le lysat cellulaire dans un tube de collecte pour extraire l’ADN total avec réaction en chaîne de la polymérase en utilisant les conditions de température décrites dans le manuscrit. Après avoir préparé les cellules comme démontré précédemment, incuber les hépatocytes avec la solution d’acide taurocholique de sodium pendant 15 minutes à température ambiante, aspirer la solution et laver les cellules trois fois avec HEPES froid. Ensuite, ajoutez 300 à 500 microlitres de HEPES froid pour récolter les cellules avec des grattoirs cellulaires sur glace.
Homogénéiser les cellules par ultrasons à 20 kilohertz pendant 20 secondes et incuber sur de la glace pendant cinq minutes. Après centrifugation à 10 000 G, prélever le surnageant et évaluer la concentration intracellulaire d’acide taurocholique à l’aide d’un kit de dosage ELISA à l’acide taurocholique. Pour laver les cellules et la seringue dans la calorimétrie de titrage isotherme ou l’instrument ITC, lancez le logiciel ITC.
Sous l’onglet Run experiment highlight (Exécuter la mise en surbrillance de l’expérience), sélectionnez la méthode micro cal pour 19 points d’injection ITCM et cliquez sur Ouvrir. Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, cliquez sur l’onglet nettoyer et dans la fenêtre de la méthode de nettoyage, sélectionnez le bouton de lavage pour la méthode de nettoyage des cellules et le bouton de rinçage pour la méthode de nettoyage de la seringue. Cliquez sur Suivant et suivez les instructions à l’écran.
Après avoir chargé l’échantillon dans l’ITC, cliquez sur le bouton de chargement présent sous l’onglet Exécuter l’expérience. Cliquez ensuite sur Suivant et suivez les instructions vidéo jusqu’à ce que cette étape de chargement soit terminée. À l’aide d’une seringue, remplir la cellule de référence avec un tampon de solution dans la cellule d’échantillon avec 15 NTCP micromolaires dans le tampon.
Retirez l’excès de solution, puis remplissez la seringue avec une solution de 150 micromolaires de ligand de curcumine, en évitant les bulles d’air. Exécutez l’exemple en cliquant sur le bouton Exécuter sous l’onglet Exécuter l’expérience. Les informations expérimentales et les paramètres seront affichés sur le côté gauche.
Entrez les concentrations de protéines du ligand et les détails de température. Cliquez sur Démarrer pour effectuer le processus d’injection. Attendez 1,4 heure pour que l’interaction du ligand protéique soit terminée.
Une fois l’injection terminée, sélectionnez le bouton d’analyse en surbrillance pour analyser les données brutes à l’aide du logiciel d’analyse. Ensuite, cliquez sur vue d’ensemble pour afficher les données brutes et choisissez le modèle d’ajustement comme un ensemble de site de liaison. Des caractéristiques de maturation hépatique ont été observées, y compris des cellules binucléées et une morphologie de forme polygonale, en particulier au stade différencié du CMH.
Une forte augmentation de l’expression du PNCP a été observée dans l’HepaRG différencié et le CMH différencié. La forme hautement glycosylée du PNCP a été détectée davantage dans le CMH différencié que dans l’hépatite hépatique différenciée. Les niveaux de NTCP étaient plus élevés dans les cellules différenciées du CMH que dans les cellules indifférenciées.
La coloration par immunofluorescence virale a évalué les activités d’entrée anti-VHB le septième jour suivant l’infection et le niveau de liaison du virus sur le récepteur de surface cellulaire a été évalué par réaction en chaîne de la polymérase en temps réel. L’analyse de l’absorption de l’acide taurocholique a suggéré que l’activité inhibitrice punitive des composés candidats diminuait la liaison du virus de l’hépatite B par le PNCP. L’altération colorimétrique a été détectée par des injections continues dans la cellule d’échantillonnage.
Une régression standard des moindres carrés non linéaires a été tracée sur la base d’un site de liaison bien adapté aux données. La ligne continue indiquait le meilleur ajustement aux valeurs expérimentales pour la liaison SBB en tant que et que les cellules et les particules virales de l’hépatite B sont incubées à quatre degrés Celsius. La mise à jour de l’acide taurocholique peut être évaluée à l’aide de la technique radioactive.
Le niveau d’acide taurocholique radioactif peut être quantifié à l’aide d’un compteur de simulation liquide. Cette technique est simple et rapide pour dépister l’entrée virale dans l’activité d’enquête de tout régime antiviral qui aiderait à prévenir l’infection ou la réinfection.
