La recherche sur le virus de l’hépatite E a été entravée par l’absence d’un système efficace de culture cellulaire. Nos techniques surmontent ces limitations ouvrant la voie à la conception de médicaments et à la mise au point de vaccins. Avec ce protocole, nous sommes en mesure de produire des virus infectieux à haut litre à la fois de particules de HEV non enveloppe et enveloppe, facilitant l’infection d’une variété de cellules.
L’exécution de ce protocole nécessite l’accès à une installation BSA-2 et une expérience des techniques de culture cellulaire de base. Pour linéariser l’ADN plasmide, mélangez 10 microgrammes de l’ADN modèle avec 10 microlitres de tampon et deux microlitres de l’enzyme de restriction micrococcus lutéus et ajustez le volume final à 100 microlitres avec de l’eau. Puis incuber la solution pendant une heure à 37 degrés Celsius et confirmer la linéarisation du plasmide par électrophoresis gel agarose selon les protocoles standard.
Après l’isolement et la linéarisation de l’ADN plasmide, le succès de la linéarisation peut être vérifié en comparant l’ADN plasmide non digéré à l’ADN plasmide digéré par électrophoresis gel. Pour la transcription in vitro de l’ADN purifié du virus de l’hépatite E, mélangez deux microgrammes du modèle d’ADN linéarisé avec les réapprovisionnements appropriés et utilisez de l’eau sans noyau pour porter le volume final de la solution à 100 microlitres. Après un mélange complet, incuber la solution pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
Après deux heures, ajouter deux microlitres supplémentaires de polymése d’ARN T7 au tube. Ensuite, mélanger la réaction et incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant encore deux heures. À la fin de l’incubation, digérer le modèle d’ADN initial avec 7,5 microlitres d’ADN avec mélange complet et incuber pendant 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Après l’extraction, vérifiez soigneusement l’intégrité de l’ARN et le rendement par électrophorèse de gel agarose selon les protocoles standard. Dans le cas d’une faible abundance des ARN, des bandes distinctes, plutôt qu’un frottis flou, devraient être observées. Certaines étapes nécessitent une exécution rapide et donc une préparation minutieuse.
En outre, portez une attention particulière à l’intégrité de l’ARN et à la viabilité des cellules. Pour préparer les cellules cancéreuses du foie humain à la production de virus de l’hépatite E dérivée de la culture cellulaire, ensemencer les cellules en 20 millilitres de DMEM complet sur un plat de culture enduit de collagène de 15 centimètres et incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence. À la fin de la culture, laver les cellules avec 10 millilitres de PBS avant de les détacher de la plaque de culture cellulaire avec trois millilitres de 0,05%Trypsin-EDTA à 37 degrés Celsius.
Resuspendez les cellules détachées en 10 millilitres de DMEM complet et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres pour le comptage. Transférer cinq fois 10 dans les six cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres et laver les cellules deux fois avec 35 millilitres de PBS par lavage. Après le deuxième lavage, placez les cellules sur la glace sans enlever le surnatant.
Pour l’électroporation des cellules cibles, compléter 384 microlitres de cytomix avec deux millimolaire ATP et cinq glutathion millimolaire, ensuite stocker sur la glace jusqu’à nouvel usage. Remplacez soigneusement le supernatant par l’ensemble des 400 microlitres de solution. Ajouter cinq microgrammes d’ARN génomique viral purifié aux cellules et transférer la suspension cellulaire à une cuvette de quatre millimètres pour l’électroporation à 975 microfarades et 270 volts pendant 20 millisecondes.
Après électroporation, utiliser une pipette Pasteur pour transférer les cellules le plus rapidement possible en 11 millilitres de DMEM complet et ensemencer 10 millilitres des cellules électroporées dans un plat de culture de 10 centimètres recouvert de collagène. Ensuite, ajouter 1,3 fois 10 à la cinquième cellule dans 300 microlitres de milieu uniformément sur un bordereau de couverture dans un puits d’une plaque de collagène enduit de 24 microtitres et placer l’assiette et le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le supernatant dans le plat par 10 millilitres de DMEM frais et retournez le plat à l’incubateur de culture cellulaire pendant six jours supplémentaires.
Le cinquième au septième jour, selon la densité cellulaire, effectuer la coloration immunofluorescente du contrôle de la transfection pour permettre le calcul du nombre de cellules exprimant la protéine cible d’intérêt normalisée au nombre total de cellules. L’électroporation réussie peut être surveillée par la coloration immunofluorescente du contrôle de transfection. L’efficacité de la transfection doit dépasser 40%Un mutant déficient en réplication peut servir de contrôle négatif pour confirmer la spécificité de la coloration.
Pour récolter les particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire extracellulaire, le sixième jour, filtrer le supernatant à travers un maillage de 0,45 microlitre pour enlever les débris cellulaires et stocker le virus de l’hépatite E dérivé de la culture cellulaire extracellulaire récolté à quatre degrés Celsius. Pour la récolte de particules du virus de l’hépatite E dérivée de la culture cellulaire intracellulaire, lavez les cellules avec PBS et détachez les cellules avec 1,5 millilitres de 0,05%Trypsin-EDTA à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec 8,5 millilitres de DMEM et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres pour centrifugation.
Ajouter 1,6 millilitres de DMEM milieu complet par électroporation à des tubes de réaction individuels de deux millilitres et utiliser 800 microlitres du milieu pour résuspendre les cellules, transférant ainsi les cellules vers les tubes. Congelez les cellules dans de l’azote liquide, puis décongelez les cellules sur la glace trois fois avant de centrifuger à grande vitesse les lysates qui en résultent pendant 10 minutes à 10 000 fois g. Ensuite, transférez les supernatants dans de nouveaux tubes sans déranger les granulés de débris cellulaires pour un stockage de moins 80 degrés Celsius.
Pour évaluer les titres des stocks de virus intra et extracellulaires nouvellement produits de l’hépatite E, semer deux fois 10 à quatre cellules pour 100 microlitres de MEM par puits dans les 60 puits du centre d’une plaque de microtitre de 96 puits recouverte de collagène et remplir les puits les plus externes de 100 microlitres de PBS par puits. Après 24 heures à 37 degrés Celsius, ajouter 50 microlitres de supernatant de particules de virus extracellulaires à la première rangée de cellules. Après avoir bien mélangé, diluer en série le contenu du puits six fois à une concentration d’un à trois par puits en transférant 50 microlitres de supernatant de la rangée précédente à la rangée suivante de cellules en double jusqu’à la dernière rangée de cellules.
Pour infecter les cellules avec des particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire intracellulaire, ajoutez 25 microlitres du supernatant de particules de virus intracellulaires à la rangée supérieure des cellules et mélangez bien avant de diluer périodiquement les cellules six fois à un rapport d’un à cinq avec 25 microlitres de dilution en double comme démontré. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant sept jours avant la coloration immunofluorescente selon le protocole dans le manuscrit. Après incubation et coloration immunitaire, les plaques peuvent être analysées à l’aide d’une microscopie d’immunofluorescence.
Après l’immunostaining le titer final des particules intra et extracellulaires peut être calculé en utilisant la formule appropriée comme indiqué. Après l’infection cellulaire cible par des particules de virus E dérivées de la culture cellulaire par dilution en série, on peut s’attendre à des titrages entre une fois 10 à la cinquième et trois fois 10 aux six unités de formation de foyer par millilitre peuvent être attendues des cultures cellulaires infectées par les particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire intracellulaire non enveloppée. Dans les cultures infectées par des particules de virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire extracellulaire enveloppée, des titres entre une fois 10 à la seconde et une fois 10 à la quatrième concentration formant des unités par millilitre sont attendus.
En outre, le rapport entre les copies du génome et les particules intracellulaires non enveloppées de virus infectieux est généralement inférieur à celui observé pour les cultures infectées par les particules du virus de l’hépatite E dérivées de la culture cellulaire extracellulaire, ce qui suggère une infectiosité spécifique plus élevée des espèces non enveloppées du virus de l’hépatite E. La production de particules virales et l’infection cellulaire cible nécessitent un cycle de vie viral complet et peuvent fournir de nouvelles informations sur les interactions virus-hôte. Ce protocole peut être modifié pour effectuer la cinétique de réplication ou pour produire des particules qui peuvent être utilisées dans les analyses d’infection.
La plupart de nos recherches dépendent actuellement de particules infectieuses, tant dans le VHS enveloppé que non enveloppé. Et des articles utilisant nos techniques sont en cours de publication.
