L’endocytose de la vésicule en cytoplasie entraîne la formation de vésicules intracellulaires. La perméabilisation de la vésicule active diverses voies de signal. L’inactivation laser assistée par chromophore est utilisée pour étudier les conséquences de la rupture des vésicules intracellulaires.
Un contrôle spatial et temporel des dommages subcellulaires aux vésicules intracellulaires peut être obtenu en ajustant la condition debout et l’éclairage lumineux. Pour commencer, maintenez la culture cellulaire HeLa dans DMEM supplémentée avec 10% FBS. Après avoir lavé les cellules avec PBS, trypsiniser les cellules.
Ensuite, remettez en suspension les cellules dans DMEM complétées par 10% FBS. Diluer 300 nanogrammes de plasmide Gal3-GFP dans 25 microlitres de milieu sérique réduit. Ajoutez ensuite 0,6 microlitre de réactif P3000.
Et mélanger doucement, puis vortex la solution. Diluer 0,45 microlitre de réactif Lipofectamine 3000 dans 25 microlitres de milieu sérique réduit et mélanger doucement. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, mélanger l’ADN dilué et la lipofectamine 3000 diluée et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir mélangé le mélange d’ADN lipofectamine, 300 000 cellules HeLa en suspension et 200 microlitres de DMEM avec 10% FBS, ensemencez les cellules sur la région vitrée centrale d’un plat de bouton en verre de 35 millimètres. Pour permettre la fixation des cellules, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’incubateur alimenté avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins quatre heures.
Diluer AlPcS2a dans du DMEM complété avec 10% FBS pour obtenir une solution d’AlPcS2a à une micromolaire. Préchauffer le milieu contenant AlPcS2a dans un bain-marie de 37 degrés Celsius et remplacer le milieu de culture par le milieu contenant AlPcS2a. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’incubateur alimenté avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit.
Le lendemain, laver les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l’AlPcS2a extracellulaire après avoir remplacé le milieu par un milieu frais. Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures pour permettre au colorant résiduel le long de la voie endocytaire de s’accumuler dans les lysosomes. Pour manipuler des cellules individuelles en endommageant les lysosomes, placez la boîte de culture sur la scène d’un microscope confocal.
Utilisez les lasers 488 nanomètres et 561 nanomètres pour exciter GFP et AlPcS2a, respectivement. Encerclez une région carrée d’intérêt de cinq micromètres sur cinq sur les vésicules marquées AlPcS2a qui sont sélectionnées pour être endommagées. Ensuite, les impulsions éclairent la région d’intérêt avec un laser de 633 nanomètres de 0,21 milliwatt, soit 70 répétitions.
Surveiller la formation de Gal3 puncta comme indicateur de perméabilisation de la membrane lysosomale. La coloration lysosomale avec AlPcS2a dans les cellules HeLa a été réalisée à l’aide de marqueurs disponibles dans le commerce et a été colorée positivement avec un colorant fluorescent vert. Les lysosomes dans les cellules HeLa exprimées par TagRFP-Galectine3 ont été colorés avec AlPcS2a.
Suivi d’une illumination focalisée avec de la lumière proche infrarouge, les résultats indiquent que l’inactivation laser assistée par chromophore à base d’AlPcS2a a été capable de contrôler la rupture lysosomale locale dans la région d’intérêt, laissant le reste des lysosomes intacts. Cette étape est importante car le temps d’incubation déterminera les endosomes debout ou les lysosomes. Par exemple, les gens peuvent déterminer la taille de par la libération de colorant imperméable à la membrane.
Peut également utiliser des colorants sensibles au pH tels que le dextran FITC pour différencier les endosomes et les lysosomes. Cette technique est utile pour commencer les effets en aval de la rupture de la membrane des vésicules intracellulaires. Et il y a des effets en aval dans diverses situations.
