Ce travail a été financé par des subventions du NIH R37 AI34867 et R01 GM064625 à NWA Nous remercions le Dr R. Tweten de l&#39;Université de l&#39;Oklahoma pour le plasmide d&#39;expression SLO.

Une. Transcriptionnelle de l&#39;ASM <ol><li> Graine de 1,5 x 10 5 cellules HeLa dans 2 ml de milieu de culture DMEM (DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1% de Penn-Strep) sur des plats de fond 35 mm en verre (MatTek) et incuber une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Le jour suivant, aspirer hors des milieux de croissance et de la remplacer par 2 ml du milieu DMEM réduite de sérum (DMEM avec du FBS à 4%), au moins 1 heure avant d&#39;ajouter le mélange de transfection de siRNA. </li><li> Préparer 4 tubes pour le mélange de transfection oligo siRNA. Dans les tubes A et C, ajouter 250 ul de Optimem sérum réduit et 4 ul de Lipofectamine RNAiMax, par boîte de 35 mm à transfecter. Dans le tube B, ajouter 250 ul de sérum Optimem réduits et 8 pi (160 pmol) de contrôle du contenu de GC moyen oligo (siRNA contrôle), par boîte de 35 mm à transfecter. Dans le tube D, ajouter 250 microlitres de sérum Optimem réduits et 8 pi (160 pmol) de SMPD1 oligo (siasme), par boîte de 35 mm to transfecter. Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Mélanger les tubes A et B pour former le complexe de transfection pour le contrôle des siRNA, et les tubes C et D pour l&#39;ASM siRNA. Incuber les réactions à la température ambiante pendant 20 min. </li><li> Ajouter les mélanges de réaction de transfection de siRNA contrôle et ASM siARN lentement, goutte à goutte, dans des plats de 35 mm de fond verre respectives et incuber à 37 ° C / 5% CO 2. À 24 h post-transfection, aspirer délicatement les médias et le remplacer par un milieu de croissance de DMEM frais. Pour ASM efficace knockdown, les plats doivent être encore incubées à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant environ 31 heures (total 55 heures) avant l&#39;imagerie en direct. </li></ol> 2. Préparation des réactifs pour la microscopie en direct <ol><li> Préparer une solution de toxine formatrice de pores recombinant streptolysine O (SLO) à une concentration de 100 ng / ul dans du PBS froid 1x sans Ca 2 + et Mg 2 +. Le SLO utilisé dans ces essais est un constitutively mutant cystéine actif qui ne nécessite pas d&#39;agents pour réduire l&#39;activité, aimablement fourni par le Dr Rod Tweten, Université de l&#39;Oklahoma. La toxine a été exprimée dans E. coli BL21 DE3 et purifiée dans des conditions natives, comme décrit précédemment 16. </li><li> Préparer la solution mère FM1-43: Remettre en suspension FM1-43 poudre lyophilisée dans du DMSO pour créer une solution de 25 mM. </li><li> Préparer la solution A: Diluer la solution mère FM1-43 dans du DMEM froid avec Ca 2 + à une concentration finale de 4 pm (1,5 ml sont nécessaires par boîte MatTek) et stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Préparer la solution B: Diluer la solution mère FM1-43 dans du DMEM froid sans Ca 2 + et 10 mM d&#39;EGTA (Ca2 DMEM + gratuit) à une concentration finale de 4 pm (1,5 ml nécessaires par boîte MatTek) et stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Pré-chaude (37 ° C) aliquotes de 1 ml de la solution A et la solution B dans des tubes Eppendorf. </li><li> Gardez sur des solutions de glace de DMEM avec Ca 2 +, et Cun DMEM 2 + libre. </li></ol> 3. Imagerie de cellules vivantes FM1-43 Afflux en SLO traités et les cellules non traitées <ol><li> Remplir un récipient métallique peu profond de taille moyenne avec de la glace pilée, l&#39;inverser dans un grand récipient en verre avec de la glace, et ajouter de la glace supplémentaire ne laissant que la surface de fond du récipient métallique exposée. Placez une serviette de papier humide sur le fond de métal exposé pour permettre le transfert thermique même. </li><li> Prenez un plat MatTek contrôle siRNA traité (échantillon 1) et placez-le sur la serviette en papier humide froid. Aspirer tous les médias et laver 3 fois avec froid Ca 2 + sans DMEM. Après le dernier lavage, aspirer hors tous les médias dans le plat. </li><li> Pour créer une image associée aux cellules FM1-43 dans des cellules qui n&#39;ont pas la blessure SLO (échantillon 1), en présence de Ca 2 +, ajouter 180 ul de solution froide B à la lamelle de verre centrale de la coupelle inférieure 35 mm verre et incuber pendant 5 min sur de la glace (tableau 1). </li&gt; <li> Placez plat MatTek sur la scène d&#39;un microscope confocal chauffé à 37 ° C et équipé d&#39;une chambre environnementale (qui maintient la température, l&#39;humidité et niveaux de CO 2). Trouver le domaine des cellules qui seront imagés en regardant à travers un 40X NA 1.3 objectif (Nikon). Si possible, mettez PerfectFocus ou un dispositif similaire à corriger la dérive thermique. </li><li> Ajouter 1 ml de solution A préchauffé doucement sur ​​le côté de la boîte de 35 mm et remettre le couvercle de la chambre de l&#39;environnement (tableau 1). </li><li> Acquérir les images de 4 min à 1 image toutes les 3 secondes en utilisant un logiciel d&#39;imagerie approprié (Volocity dans le système de filage de la microscopie confocale UltraView disque Vox Perkin Elmer). L&#39;excitation du FM1-43 est effectuée avec un rayon laser de 488 nm en utilisant un filtre dichroïque avec un passe-bande de 488 nm, et la discrimination d&#39;émission est réalisée par utilisation d&#39;un filtre 527 (W55) d&#39;émission. des niveaux de puissance de laser et de la sensibilité de la caméra sont réglés pour réaliser des expositions d&#39;image de 100 msec. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.6 pour détecter FM1-43 dans les cellules traitées siRNA contrôle sans blessure SLO (échantillon 2) en l&#39;absence de Ca 2 +, sauf que lors de l&#39;étape 3.5 Solution B devrait être ajouté (tableau 1). </li><li> Pour mesurer FM1-43 flux dans des cellules de contrôle siRNA traités blessées avec SLO soit en présence (échantillon 3) ou en l&#39;absence de Ca 2 + (échantillon 4), ajouter 180 ul de froid la solution B contenant SLO à la lamelle de verre centrale de la 35 mm plat à fond de verre et incuber pendant 5 min sur la glace que dans l&#39;étape 3.3. Répétez les étapes 3.2 à 3.6; ajuster ajoutant soit la solution A ou la solution B à l&#39;étape 3.5 (tableau 1). </li><li> Pour déterminer le rôle de l&#39;ASM dans le plasma réparation de la membrane, répétez les étapes 3.2 à 3.6 en utilisant des cellules de siARN traité ASM pour toutes les conditions (échantillons 5-8) (Tableau 1). </li><li> Pour déterminer le rôle de la sphingomyélinase extracellulaire recombinant (SM) sur lacinétique de réparation de la membrane plasmatique (réfléchis par l&#39;inhibition de l&#39;afflux FM1-43) (échantillons 9 à 10), on ajoute SM (0-50 uU) soit à la solution A ou la solution B à l&#39;étape 3.5, et ensuite ajoutés aux cellules pendant cellules vivantes imagerie dans un volume total de 1 ml (tableau 1). </li></ol> 4. Quantification de FM1-43 Afflux dans les cellules <ol><li> Après films ont été acquis, mesurer l&#39;intensité de fluorescence intracellulaire de FM1-43 en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image (Volocity Suite, PerkinElmer). Tirage d&#39;une région d&#39;intérêt dans la région cytosolique de chaque cellule dans le champ et à appliquer les outils logiciels pour déterminer la moyenne FM1-43, l&#39;intensité de fluorescence dans toutes les trames de la vidéo. </li><li> Pour tenir compte des variations dans la première FM1-43 coloration, les données de chaque vidéo est exprimé en pli augmentation de l&#39;intensité de fluorescence au cours du temps, et tracées pour chaque condition différente. Le facteur d&#39;augmentation de la fluorescence de chaque heure individuelle parcellule est calculé comme F T / F 0, où F T est la fluorescence moyenne au point de temps spécifique, et F 0 est la fluorescence moyenne à t = 0 (Figures 1-2). </li></ol>

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	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Des études antérieures sur blessure mécanique et la membrane plasmique réparation invoqués divers mécanismes de cellules blessant, allant de l&#39;abandon des perles de verre, micropipetage, cisaillement, gratter ou racler. La lecture de tous ces essais était qualitative plutôt que quantitative, et ne donne pas d&#39;informations précises sur la cinétique du mécanisme de réparation. La capacité des cellules à resceller leur membrane plasmique après ces formes de lésion a été mesurée en présence ou en...

Il est connu depuis plusieurs décennies que la réparation de la membrane plasmatique après une lésion mécanique est un 1,2 Ca 2 + de procédé dépendantes. Des études ultérieures ont montré que l&#39;influx de Ca2 + à travers la plaie déclenche un processus dynamique de l&#39;exocytose de vésicules intracellulaires au niveau du site de lésion, qui est nécessaire pour resceller 3,4. Le taux de perte d&#39;un colorant fluorescent chargé dans le cytoplasme des cellules a été utilisé pour évaluer la vitesse de réparation, et a conclu que rescellement a été achevée à l&#39;intérieur de &lt;30 s après la lésion 5. Deux modèles ont d&#39;abord été proposés pour expliquer la nécessité d&#39;exocytose dans la réparation de la membrane plasmique: 1) le modèle de «patch», ce qui suggère que influx de Ca2 + à travers la lésion déclenche fusion initialement homotypique des vésicules intracellulaires, formant un grand &quot;patch&quot; qui serait ensuite être appliquée sur la membrane plasmique de refermer la plaie 6 et 2) le modèle de réduction de la tension, qui a proposé que la membrane Added par Ca 2 +-dépendante exocytose dans le voisinage de la blessure serait de réduire la tension de la membrane plasmatique, ce qui facilite refermeture de la double couche 7. Le rôle de Ca 2 + exocytose déclenchée dans le plasma réparation de la membrane a été renforcée par des études montrant que les lysosomes contiennent une molécule Ca 2 + du capteur, synaptotagmine VII, ce qui facilite leur exocytose et plasma réparation de la membrane dans les cellules lésées 8,9,10,11 . Toutefois, une preuve supplémentaire a indiqué que l&#39;exocytose seul n&#39;était pas suffisant pour promouvoir plasma réparation de la membrane. En plus de larmes mécanique sur la membrane plasmique, une forme fréquente de lésion cellulaire est la perméabilisation par les toxines formant des pores produits par des bactéries ou des cellules immunitaires 12,13 14,15. Contrairement aux déchirures mécaniques, des protéines formant des pores s&#39;insèrent sur la membrane plasmique de formage, une protéine de pore bordée stable qui ne peut être refermé simplement en appliquant une membrane &quot;patch&quot; ou par réductionment la tension de la membrane. Curieusement, des études ont révélé que les cellules de mammifères possèdent un mécanisme efficace pour la réparation de leur membrane plasmique après perméabilisation avec des protéines formant des pores, ce procédé nécessite également la présence de Ca 2 + extracellulaire 12. Cette découverte a soulevé la question de savoir si le retrait transmembranaire des pores de la surface de la cellule a également été un processus rapide, comme on l&#39;observe avec des blessures mécaniques 5. De manière surprenante, les études récentes ont révélé que la refermeture de cellules perméabilisées avec des toxines formant des pores a des propriétés très similaires à la réparation des plaies mécaniques: le procédé nécessite le Ca2 + extracellulaire, et est achevée dans ~ 30 sec. Enquêter sur ce processus plus en détail, nous avons récemment appris que, en plus de Ca 2 exocytose + réglementés des lysosomes, la réparation de la membrane plasmique implique une forme rapide de l&#39;endocytose, qui est déclenchée par la libération de l&#39;enzyme lysosomale sphingomyelinase acide (ASM) et est essentiel non seulement pour ee retrait de pores transmembranaires, mais également pour la réparation de plaies mécaniques 16. Pour déterminer la cinétique de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, dans notre laboratoire, nous avons adapté une méthodologie d&#39;imagerie en temps réel qui a été utilisée précédemment pour évaluer refermeture de fibres musculaires isolées laser blessé 17. Ce dosage repose sur les propriétés du colorant lipophile FM1-43, qui s&#39;intercale de manière stable dans le feuillet externe de bicouches lipidiques augmentation de l&#39;intensité de fluorescence. Lorsque le plasma membrane bicouche est perturbé gains de colorant extracellulaire accès à des membranes intracellulaires, en fournissant un dosage sensible pour détecter un dommage de la membrane plasmique et réparer 18,16,19,20. Afin d&#39;adapter ce test pour l&#39;évaluation de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, on les cellules pré-incubées à 4 ° C avec la toxine bactérienne streptolysine O (SLO), qui se lie à la membrane 21 de cholestérol. Cellule synchroneperméabilisation peut alors être facilement réalisé en déplaçant les cellules à partir de la glace se réchauffer milieu dans une platine de microscope chauffée, ce qui active l&#39;oligomérisation et le changement de conformation qui conduit à la formation de pores transmembranaires. Un avantage de cette approche, au cours des essais publiés précédemment à l&#39;aide de la blessure au laser, est qu&#39;un grand nombre de cellules peuvent être analysées simultanément dans un champ microscopique, offrant un meilleur échantillonnage de la population de cellules. Compte tenu des similitudes entre le processus mécanistes de refermeture de la cellule vu après une blessure mécanique et perméabilisation des toxines formant des pores, le test que nous décrivons ici fournit une méthode très puissante et polyvalente pour des facteurs impliqués dans le processus fondamental de plasma réparation de la membrane de dissection. A titre d&#39;exemple, on montre qu&#39;il est possible d&#39;utiliser ce dosage pour identifier les mesures de Ca2 + dépendants et indépendants du processus de réparation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

Blessures de la membrane plasmatique est un événement fréquent, et les plaies doivent être réparés rapidement pour assurer la survie cellulaire. Influx de Ca 2 + est un événement de signalisation clé qui déclenche la réparation de plaies mécaniques de la membrane de plasma à l&#39;intérieur ~ 30 sec. Des études récentes ont révélé que les cellules de mammifères reboucher aussi leur membrane plasmique après perméabilisation de formation de pores toxines dans un processus 2 +-dépendante Ca implique que l&#39;exocytose de la sphingomyélinase acide enzyme lysosomale suivie pores endocytose. Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour démontrer que la refermeture de cellules perméabilisées par la toxine Streptolysine O est aussi rapide et dépend influx de Ca2 +. Le design de dosage permet la synchronisation de l&#39;événement de blessure et une mesure cinétique précise de la capacité des cellules à restaurer l&#39;intégrité de membrane plasmique par l&#39;imagerie et la quantification de la mesure dans laquelle le colorant lipophile FM1-43 atteint les membranes intracellulaires. Ce concert als essaio sensible permet une évaluation de la capacité des facteurs solubles ajouté de manière exogène, tels que la sphingomyélinase pour inhiber l&#39;influx FM1-43, ce qui reflète la capacité des cellules à réparer leur membrane plasmique. Ce test a permis de montrer pour la première fois que la sphingomyélinase agit en aval de Ca 2 +-dépendante exocytose, puisque l&#39;addition de l&#39;enzyme extracellulaire favorise la refermeture de cellules perméabilisées en l&#39;absence de Ca 2 +.

De faibles concentrations de bactéries sphingomyélinase (SM) sauvetage réparation de la membrane plasmatique dans des cellules appauvries en sphingomyélinase acide lysosomale. En utilisant le test de formation d&#39;image FM1-43, nous avons précédemment montré que des cellules déficientes pour l&#39;ASM enzyme lysosomale et exposés à SLO blessant en présence de Ca 2 + ont un défaut de la membrane plasmique est recueilli par addition extracellulaire de l&#39;enzyme humaine...

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Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Imagerie en temps réel des cellules exposées au colorant lipophile FM1-43 permet une détermination précise de la cinétique par lequel les toxines formant des pores sont enlevés de la membrane plasmique. Il s&#39;agit d&#39;un test sensible qui peut être utilisée pour évaluer les exigences de Ca 2 +, la sphingomyélinase, et d&#39;autres facteurs de réparation de la membrane plasmatique.

Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

11.6K vues.  University of Maryland.  Imagerie en temps réel des cellules exposées au colorant lipophile FM1-43 permet une détermination précise de la cinétique par lequel les toxines formant des pores sont enlevés de la membrane plasmique. Il s'agit d'un test sensible qui peut être utilisée pour évaluer les exigences de Ca 2 +, la sphingomyélinase, et d'autres facteurs de réparation de la membrane plasmatique. 

Vidéo: Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Recherche

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques d&#39;imagerie Ca 2 + Signalisation dans le sperme humain

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Résonance de spin électronique Micro-imagerie d&#39;espèces vivantes pour la cartographie d&#39;oxygène

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Le / GFP-FLP Méthode tomate / FRT pour l&#39;imagerie en direct de mosaïque adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; cellules photoréceptrices

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...