Nous remercions le Dr Jennifer Emtage pour la lecture critique du manuscrit, Ryan Gill pour l&#39;assistance technique et aide pour les soins du poisson zèbre et le Dr Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) pour les réactifs. Notre travail a été soutenu par l&#39;University College Temple de la science et de la technologie et le National Institutes of Health (R01-HD061749).

Une. La production de la génération F0 par microinjection du piège de Gene. Nous avons trouvé que les embryons de différentes origines génétiques présentent des tolérances différentes à cette procédure, de type sauvage à base de PET magasin et Tübingen - Long Fin (TLF) étant les plus tolérants alors que les souches AB et Tübingen ont une survie plus faible. <ol><li> Préparation de l&#39;ADN du transposon. Préparer GBT-B1 (pDB783, Balčiūnienė et al. Dans la préparation) ADN plasmidique en utilisant le kit QIAprep miniprep standard (Qiagen 27106). Il est essentiel de comprendre l&#39;étape de lavage de PB (qui est facultative dans la procédure QIAprep), sinon l&#39;ADN miniprep sera contaminé par la RNase A, qui conduit à la dégradation de l&#39;ARNm de la transposase. Avant l&#39;injection, diluer l&#39;ADN dans l&#39;eau sans RNase (Ambion AM9937) à 10 ng / ul. </li><li> Préparation de l&#39;ARNm de transposase. Linéariser pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 en utilisant XbaI et transcrire l&#39;ADN linéarisé en utilisant une machine T3 mMessage(Ambion AM1348) dans le kit de transcription in vitro. Nous avons modifié la réaction de transcription in vitro en ajoutant 0,5 pi d&#39;inhibiteur RiboLock RNase (ThermoFisher Fermentas EO0381). Après l&#39;étape de traitement à la DNase, de purifier l&#39;ARNm en utilisant un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Évaluer la qualité de l&#39;vitro de l&#39;ARNm transcrit par électrophorèse en gel d&#39;agarose. Diluer l&#39;ARNm dans l&#39;eau sans RNase à 40 ng / ul, et stocker que 2 aliquotes à -80 ° C. </li><li> Préparation du mélange de micro-injection. Avant l&#39;injection, ajouter 8 pi d&#39;ADN de transposon diluée à une partie aliquote de 2 pl de la transposase de l&#39;ARNm. </li><li> La micro-injection. Injecter 3 nl de mélange ADN / ARN dans le jaune de 1 embryons de poisson zèbre de cellulaire en utilisant des techniques de micro-injection standards, visant pour l&#39;interface jaune / blastomère. Recueillir des embryons toutes les 20 minutes pour assurer une injection à une étape de la cellule. Dans notre expérience, une personne habile peut facilement injecter 1.000 embryons en 1-1,5 heures. </li><li> Après l&#39;injection, course 5 pi de gaucheau-dessus de la solution d&#39;injection sur un gel d&#39;agarose à 1% pour le contrôle de la qualité, de sorte que l&#39;ARNm de transposase n&#39;a pas été dégradé. </li><li> Injection soins de l&#39;embryon. En fin d&#39;après midi, enlever les embryons non fécondés et les embryons anormaux et distribuer à 60-80 pour 100 mm boîte de Petri. Embryons anormaux et mortes sont éliminées après la fécondation à 1 jour (DPF), 2 dpf et 3 dpf. </li><li> Criblage pour l&#39;expression de la GFP. embryons d&#39;écran sans défauts manifestes pour fluorescence de la GFP à 3 dpf (Figure 3). Le criblage peut être effectué soit sur un stéréomicroscope équipé d&#39;une fluorescence (nous utilisons un SMZ1500 Nikon) ou sur un microscope droit (nous utilisons un AxioImager Zeiss avec un objectif 5X Fluar). Faible expression de la GFP indique soit injection infructueuse ou de la dégradation de l&#39;ARN de la transposase due à une contamination de RNase (figure 3A). Sélectionner environ 30% des embryons les plus brillants qui soit sont l&#39;expression de GFP dans de nombreux tissus ou dans un fort pourcentage de cellules d&#39;un tissu particulier (F comparerFIGURES 3B et 3C). D&#39;une injection de 1000 embryons, on a généralement jusqu&#39;à 100 haut-exprimant la GFP embryons au stade de développement normales,. </li><li> Levez embryons F0 sélectionnés à l&#39;aide des procédures d&#39;élevage de poisson zèbre standard. Il est raisonnable de s&#39;attendre à ce que 20-30% des embryons injectés sélectionnés pour l&#39;élevage va survivre à l&#39;âge adulte. </li></ol> 2. Maintien de la SAMU: mRFP Tester ligne. Nous avons généré une 14xUAS: ligne mRFP marquée par γCry spécifique objectif: GFP. Depuis SAMU est soumis à du silence par méthylation de l&#39;ADN, il est important de choisir des poissons avec de faibles niveaux de silence à propager le stock. <ol><li> Mettre en place SAMU individu: homozygotes rapport de la direction pour l&#39;accouplement avec l&#39;un de nos lignes de piégeage de gène Gal4 plus fiables, tpl6 NSF (Balčiūnienė et al en préparation.). </li><li> Le lendemain, le transfert des UAS: poissons mRFP qui ont donné des embryons de réservoirs statiques individuels, tandis que les embryons sont collectéset nettoyé. </li><li> embryons d&#39;écran pour la GFP et la fluorescence de la DP à 1 dpf et 3 dpf. </li><li> Poissons Intercross qui a donné des embryons avec l&#39;expression élevée mRFP pour établir la prochaine génération de la SAMU: ligne mRFP. </li></ol> 3. Projection du poisson F0. <ol><li> Traverser F0 individu avec le SAMU homozygote: poissons mRFP (Figure 4). Nous injectons habituellement nos GBTS en lignes avec des motifs de type sauvage ou léopard pigmentation, et nos SAMU homozygotes: ligne mRFP est en laiton fond. Par conséquent poisson F0 GBT-injecté peut être facilement distingués des SAMU: poissons mRFP, éliminant la nécessité d&#39;enregistrer si la F0 le dépistage était un mâle ou une femelle, ainsi que les erreurs potentielles résultant des erreurs dans l&#39;enregistrement et / ou de déterminer le sexe de chaque poisson. Personnel ayant une expérience très limitée, ces étudiants de premier cycle nous, sont donc en mesure de mettre en place et de briser les accouplements de poissons. Cette approche présente un inconvénient que deux fonds génétiques différents sontutilisé, potentiellement compliquer l&#39;interprétation de la perte de phénotypes de fonction. </li><li> Le lendemain, retournez les SAMU en laiton: poissons mRFP de leur réservoir. Placer le poisson de F0 qui a donné des embryons dans des réservoirs statiques individuels (nous utilisons Hagen Exo Terra Faunarium Petit, mais tout petit réservoir peut être utilisé à cette fin), tandis que les embryons sont collectés et examinés. </li><li> Embryons propres et transfert recueillies dans de nouvelles boîtes de Pétri (&lt;100 par boîte) dans l&#39;après-midi du jour 0. </li><li> embryons d&#39;écran pour la GFP et la fluorescence de la DP à 1 dpf, 2 dpf et 3 dpf. Tirez embryons positifs à la fois pour la GFP et RFP sur, les trier par GFP / motif d&#39;expression DP (si plus d&#39;un modèle est observé dans un embrayage) et de les élever à établir génération F1. </li><li> Euthanasier les poissons de F0 qui ne produit que des embryons négatifs (sur un nombre total de 50-100 embryons). </li><li> Traversez le poisson F0 qui a produit de nouveau GFP / RFP positif progéniture pour obtenir un deuxième lot de points positifs. </li></ol> 4.Projection du poisson F1. Le poisson de F1 sont criblés d&#39;établir familles F2, pour documenter modèle d&#39;expression de piégeage de gènes et de geler des lots d&#39;embryons pour l&#39;identification moléculaire de piégeage de gènes loci par 5 &#39;RACE et PCR inverse. <ol><li> Traverser poissons F1 individu avec le SAMU homozygote: poissons mRFP (Figure 4). </li><li> Le lendemain, placez le poisson de F1 qui a donné des embryons dans des réservoirs statiques individuels alors que les embryons sont collectés et examinés. </li><li> embryons d&#39;écran pour la GFP et la fluorescence de la DP à 1 dpf, 2 dpf et 3 dpf. Embryons distincts et photographie positifs à la fois pour la GFP et RFP 24. </li><li> À 5 dpf, geler des lots de 20 GFP / DP-positif et 20 GFP / embryons de la DP-négatif pour l&#39;identification de gènes mutés par insertion par PCR inverse et 5 &#39;RACE 9,10. Levez restants GFP / embryons de la DP-positif d&#39;établir génération F2. </li></ol>

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Ces auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les vecteurs de pièges de gène et de la méthodologie décrits ici sont déjà utilisés dans plusieurs laboratoires indépendants. Dans notre expérience, il ya deux étapes importantes dans le processus. La première étape critique est d&#39;atteindre des taux élevés d&#39;intégration de piégeage de gènes dans des embryons de F0 injectés. L&#39;échec de cette étape peut souvent être attribuée à la contamination des réactifs RNase d&#39;injection, en particulier l&#39;ADN miniprep. Il est également très important d&#39;injecter des embryons au stade 1 cellule pour des expériences de piégeage de gènes. Dans notre expérience, la transgénèse Tol2 médiation est très efficace, ce qui permet d&#39;obtenir des lignées transgéniques, même lors de l&#39;injection plus tard au stade 1 cellule ou avec de l&#39;ADN de qualité inférieure. Injections normes sont beaucoup plus problématique dans l&#39;exercice de piégeage de gènes mutagenèse, puisque seule une petite fraction des intégrations vecteur résultat des événements efficaces de piégeage de gène. La deuxième étape critique est de savoir intercepter les événements de gènes par croisement à notre SAMU: ligne mRFP. Absence d&#39;expression est mRFPpresque toujours le signe d&#39;un événement activateur de piège. Cependant, parfois, le manque d&#39;expression mRFP peut indiquer silence des 14x SAMU. Il est donc important de maintenir la SAMU: ligne mRFP dans un état ​​non-réduit au silence par la propagation de la prochaine génération utilisant des individus avec une expression élevée de DP quand on les croise à tpl6 NSF. Nous pouvons prévoir de faire plusieurs améliorations à nos vecteurs de pièges de gène et le protocole. La première consiste à utiliser un UAS moins répétitif dans la construction de piégeage de gènes. Il a été montré qu&#39;une 5x UAS est suffisante pour obtenir une activation complète dans des expériences de culture de cellules, et que les séquences UAS moins répétitives sont moins sensibles à la méthylation et 6,25 taire. Il peut également être possible de concevoir des gènes vecteurs de pièges pour la mutagenèse conditionnelle entièrement, par analogie avec les vecteurs utilisés par le piège à souris du gène consortium international et récemment adaptées pour le poisson zèbre 2,26,27. Une autre amélioration serait d&#39;utiliser un autre tsystème ransposon, par exemple Sleeping Beauty 28, pour générer un UAS: mRFP ligne de journaliste. Cela permettrait injection de pièges de gènes à base de Tol2 directement dans la ligne de journaliste et de dépistage de F0s par incrossing. En outre, ce serait d&#39;éliminer l&#39;utilisation de deux fonds génétiques différents, ce qui rend l&#39;interprétation de la perte de phénotypes de fonction plus simple. Même avec ces améliorations, la Gal4 protocole général de piégeage de gènes présenté ici serait encore pleinement applicable.

La mutagenèse par insertion s&#39;est avérée être une approche puissante pour disséquer la fonction des gènes dans différents systèmes modèles à partir d&#39;organismes unicellulaires tels que des bactéries et des levures à des organismes multicellulaires tels que les souris et les plantes. De préférence de l&#39;ADN exogène (virus, plasmide ou transposon) peut servir comme un agent mutagène en interrompant éléments essentiels de gènes tels que des promoteurs ou des exons. La cible effective de ces approches simples est extrêmement faible dans de grands génomes complexes, étant donné que les exons comprennent seulement 1-3% d&#39;un génome de vertébré typique. Petite taille cible efficace peut être surmontée par des taux d&#39;intégration très élevé de vecteur, comme en témoigne l&#39;énorme succès de la mutagenèse par insertion rétrovirale chez le poisson zèbre 11,12. En revanche, les introns comprennent environ 20 à 30% des génomes de vertébrés. Chez le poisson zèbre, d&#39;insertion des vecteurs de mutagenèse à base de transposons qui introduisent effectivement nulle ou mutations hypomorphic graves sur l&#39;intégration dans les introns ont été nommés &quot;transposo de gène de rupturens &quot;(GBTS) 8-10. Pour une intégration efficace de piégeage de gènes, ils utilisent un Tol2 transposon minimale 13,14. Mutagénicité de GBTS repose sur les poissons dérivé accepteur d&#39;épissage et de la transcription des séquences terminaison / polyadénylation. Les éléments responsables de GBT mutagène sont flanqués par des sites loxP directes pour l&#39;excision par la recombinase Cre. Ainsi, l&#39;injection de Cre ARNm conduit à la réversion efficace des mutations induites par GBT, bien que certaines séquences de transposon restent au niveau du locus d&#39;intégration 9,10. Les vecteurs GBT récemment publiés utilisent mRFP comme le piège de gène rapporteur 9,10, conduisant à deux inconvénients potentiels. Tout d&#39;abord, on ne sait pas quelle fraction de gènes de poisson zèbre sont exprimés à un niveau suffisamment élevé pour être détecté par des protéines de fusion fluorescentes journaliste directs. Deuxièmement, seul un petit sous-ensemble de gènes devraient avoir des fonctions essentielles. Il a été estimé qu&#39;il n&#39;y a que 1,400-2,400 gènes nécessaires pour dével poisson zèbrent 15,16. La plupart des mutants de piège à gènes ne devraient pas afficher les phénotypes visibles et auront donc une utilité limitée. Pour surmonter ces deux limitations, nous avons modifié GBT-R15 9,10 à utiliser avec Gal4-VP16 comme le principal journaliste de piégeage de gènes (Balčiūnienė et al. Dans la préparation). Comme avec AUG-mRFP moins dans GBT-R15, le site d&#39;initiation de la traduction a été retiré de Gal4-VP16. Pour la détection directe des événements de piège à gènes, nos vecteurs contiennent un rapporteur de l&#39;EGFP sous le contrôle de 14x Gal4 SAMU 17,18. Plusieurs fonctionnalités supplémentaires sont conçus dans notre vecteur de piégeage de gènes bipartite. Les SAMU: cassette eGFP est flanqué par des sites FRT directs (des chevrons gris sur la figure 1). Injection de recombinase Flp ARNm conduit à l&#39;excision de l&#39;UAS: Cassette eGFP, laissant la mutation de piégeage de gènes pas marquées par fluorescence eGFP. Il peut ensuite être utilisé dans des lignées transgéniques qui marquent des tissus spécifiques ou à des événements de développement par fluorescence de la GFP. Comme dans les autresGBTS, toute la cassette de piège à gène est flanqué par des sites loxP directs (pentagones ouvertes dans la figure 1). Cela rend les événements de piège à gènes réversibles par l&#39;expression de la recombinase Cre, facilement établir la preuve de la relation de causalité entre une intégration spécifique de piégeage de gènes et observé phénotype (Figure 2). Enfin, la cassette de piège à gène est flanqué par des sites inversées méganucléase I-Scel (triangles noirs sur la figure 1). Chez la drosophile, les intégrations de transposons sont souvent convertis en suppressions (lacunes) par excision imprécise de l&#39;élément de P. Il n&#39;existe aucune preuve que l&#39;excision du transposon Tol2 (ou tout autre transposon actif chez les vertébrés tels que Sleeping Beauty, PiggyBac ou Ac / Ds) peut conduire à des suppressions. Nous avons donc inclus sites I-Scel comme une méthode de substitution potentiel pour l&#39;induction de suppressions, même si rien ne prouve que I-Scel peut induire des délétions chez le poisson zèbre. Il convient de noter que, bien que I-Scel méganucléase peut être utilisé pour faciliter la transgénèse chez le poisson zèbre, clivage de l&#39;ADN par méganucléase I-Scel est utilisée pour étudier les mécanismes de réparation d&#39;ADN, y compris les erreurs fin non homologue rejoindre, dans la levure et les cellules de mammifères 19-22. Intégration de notre vecteur de piégeage de gène peut conduire à l&#39;expression eGFP par deux mécanismes différents. Le premier est un véritable événement de piégeage de gènes (figure 1C): le vecteur s&#39;intègre dans un gène (IMG pour par insertion gène mutant), un transcrit de fusion entre la 5 &#39;de la transcription endogène IMG et le Gal4-VP16 est faite et traduits en un protéine de fusion contenant la terminaison N de la protéine codée par IMG et Gal4-VP16. Cette protéine de fusion se lie à l&#39;UAS 14x et active la transcription de eGFP. Le second cas, moins souhaitable est un piège d&#39;activateur (figure 1D): le promoteur minimal devant eGFP tombe sous le contrôle d&#39;un amplificateur à proximité du site d&#39;intégration, ce qui conduit à la production de eGFP dans la absence de production Gal4-VP16. Dans notre estimation, 30-50% des événements d&#39;expression eGFP sont dus à un piège à un amplificateur et 50-70% sont dus à un piège de gène 23 (Balčiūnienė et al. Dans la préparation). Pour faire la distinction entre ces deux catégories d&#39;événements, nous avons fait un 14xUAS: mRFP lignée transgénique (figure 1B), pour plus de commodité marquée par spécifiques lentille γCry: (. Balčiūnienė et al en préparation) GFP. Gene événements d&#39;interruption sont contrôlés par la co-expression de GFP et RFP (comparer C et D sur la figure 2). Dans l&#39;écran de pilote, nous avons récupéré plus de 40 événements de piège à gènes après criblage 270 F0 poissons injectés avec un mélange d&#39;ADN de transposon et la transposase ARNm. Deux de nos intégrations de piège à gènes ont eu lieu dans des gènes avec déjà publiés mutants chimiquement induites: NSF et ét. Les phénotypes de notre mutants d&#39;insertion tpl6 NSF et ét tpl24 sont superficiellement impossible de distinguer le phénotypes des mutants chimiquement induites correspondantes. Nous avons également remarqué que les événements de piège à gènes semblent biaisées vers les introns près de l&#39;extrémité 5 &#39;des gènes, augmentant ainsi la probabilité d&#39;allèles nuls. Nous faisons observer un certain degré de SAMU silence (panaché) dans l&#39;ensemble de nos lignes de piégeage de gène, et certains lieux sont nettement plus sensibles à la bigarrure que d&#39;autres. Nous ne croyons pas que la SAMU silence est un problème important pour la propagation de lignes de piégeage de gène, comme nous l&#39;avons été en mesure de se propager facilement l&#39;ensemble de nos lignes de piégeage de gène par au moins cinq générations par la sélection pour l&#39;expression de la GFP seule.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Grande taille de l&#39;embrayage et du développement externe d&#39;embryons de poisson zèbre optiquement transparents font un système de modèle vertébré exceptionnelle pour la mutagenèse par insertion in vivo en utilisant journalistes fluorescents pour marquer l&#39;expression de gènes mutés. Plusieurs laboratoires ont construit et testé des vecteurs d&#39;amplificateur et de piégeage de gènes chez le poisson zèbre, en utilisant des protéines fluorescentes, des activateurs de la transcription à base de lexA Gal4 et que les journalistes 1-7. Ces vecteurs ont deux inconvénients potentiels: rigueur optimale (par exemple, le manque de capacité de se différencier entre les événements d&#39;amplificateur et de piégeage de gènes) et une faible mutagénicité (par exemple, les intégrations dans des gènes rarement produites allèles nuls). Gene rupture transposon (GBTS) ont été développés pour répondre à ces inconvénients 8-10. Nous avons modifié l&#39;un des premiers vecteurs GBT, GBT-R15, pour une utilisation avec Gal4-VP16 comme le principal journaliste de piégeage de gènes et SAMU ajoutés: eGFP comme le journaliste secondaire pour la détection directe des événements de piège à gènes. Application de Gal4-VP16 comme le principal journaliste de piégeage de gènes offre deux avantages principaux. En premier lieu, il augmente la sensibilité de gènes exprimés à de faibles niveaux d&#39;expression. Deuxièmement, il permet aux chercheurs d&#39;utiliser des lignes de piégeage de gènes que les pilotes Gal4 à l&#39;expression directe d&#39;autres transgènes dans les tissus très spécifiques. Cela est particulièrement pertinent pour les gènes ayant des fonctions non essentielles ou redondants, où l&#39;intégration de piégeage de gènes peut pas donner lieu à des phénotypes manifestes. L&#39;inconvénient d&#39;utiliser Gal4-VP16 comme le primaire reporter de piégeage de gènes est que les gènes codant pour des protéines avec des séquences signal N-terminales ne se prêtent pas à la trappe, comme les protéines de fusion Gal4-VP16 qui en résultent sont peu susceptibles d&#39;être en mesure de pénétrer dans le noyau et activent transcription. Fait important, l&#39;utilisation de Gal4-VP16 ne pas pré-sélectionner pour des protéines nucléaires: nous avons récupéré mutations de piégeage de gènes dans des gènes codant pour des protéines qui fonctionnent dans le noyau, le cytoplasme et la membrane plasmique.

Dans une injection réussie, au moins 80% des embryons injectés avec le piège de gène d&#39;ADN / ARNm transposase Tol2 mélange afficher un certain degré de fluorescence de la GFP (Figure 3). Lorsque les brillants GFP-positives embryons (figure 3C) sont sélectionnés pour établir la piscine de F0, environ un sur 10 blindé poisson F0 cédera gène piège progéniture. Parmi les poissons de F0 à partir de laquelle des événements de piégeage de gènes sont récupérées, plus transmettre un seul événement de piégeage de gènes en plus de plusieurs intégrations de transposon non-exprimant. Cependant, nous avons mis en place jusqu&#39;à quatre lignes de piégeage de gène d&#39;un seul individu F0. Profils d&#39;expression GFP / DP dans les lignes de piégeage de gènes vont de très spécifique du tissu (par exemple en bulbes olfactifs) à assez omniprésent. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figure 1. Til GAL4 contenant le vecteur de piégeage de gènes bipartite GBT-B1 et ses applications. A. Composantes du vecteur de piégeage de gènes Gal4 contenant: Tol2 5 &#39;et Tol2 3&#39;, minimal Tol2 transposon se termine 13; cSA, Carp β-actine accepteur d&#39;épissage 8; ^ Gal4-VP16, AUG-moins Gal4-VP16; zp ( A), β-actine UTR et poly poisson zèbre 3 &#39;(A) des éléments de GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP et SV40 p (A) sont des composants de la SAMU: eGFP cassette d&#39;expression 17,18. La flèche indique l&#39;activation de la SAMU: eGFP par Gal4-VP16 produit par le piège de gène B. Le 14XUAS:. MRFP transgène marquée par une γCry spécifique-objectif: la cassette GFP. La flèche indique l&#39;activation de la SAMU: mRFP par Gal4-VP16 en trans événement piège C. Gene.. Boîtes bleues sont exons. Épissage est indiquée par la ligne en pointillés. Événement de piège D. Enhancer. L&#39;intégration du vecteur à proximité d&#39;un activateur (boîte marron) peut placer le promoteur de eGFP minimale sous le contrôle de cet amplificateur (flèche marron). Cela se traduirait par une expression tissu-spécifique de la EGFP, mais étant donné que Gal4-VP16 n&#39;est pas fait, l&#39;expression mRFP ne serait pas activé. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figure 2. Réversion des événements de piégeage de gène en utilisant la recombinase Cre. A, B. Schéma d&#39;une mutation de piégeage de gènes (A) et la Cre-revenue allèle de piégeage de gènes (B). C, D. Co-expression de GFP (C) et DP (D) dans le système nerveux du gène tpl6 nsf ligne de piège. E, F. Injection de Cre ARN dans des embryons de tpl6 NSF conduit à la perte de la GFP (E) et DP (F) l&#39;expression. Notez qu&#39;il n&#39;y a pas de réduction de l&#39;expression de GFP dans le verre, comme prévu. Figure 3. Embryons injectés avec le GBT-B1 (pDB783) piège de gène. . A. Les embryons injectés avec pGBT-B1 (pDB783) d&#39;affichage seuls peu de fluorescence de la GFP dans le corps B, C. Les embryons injectés avec pGBT-B1 et Tol2 transposase ARNm: un groupe aléatoire de l&#39;embryon (B) et le haut-expresseurs sélectionnés pour l&#39;élevage (C). <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figure 4. Plan expérimental pour l&#39;établissement de Gal4 lignes de piégeage de gène. Structures rouges / vert qui se chevauchent partiellement indiquent co-expression de la GFP et DP, tandis que le vert indique seule mosaïque pour piéger de gène ou un amplificateur piège événements.

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Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Ce protocole décrit la méthode de piégeage de gènes mutagenèse insertionnelle utilisant Gal4-VP16 comme le journaliste primaire et GFP / DP en tant que reporters secondaires chez le poisson zèbre. Environ une personne sur dix co-exprimant haut exprimant F0 gène de rendement de piège à poissons progéniture GFP et DP. La procédure de criblage peut être facilement mis à l&#39;échelle pour s&#39;adapter à la taille du laboratoire effectuant l&#39;écran de mutagenèse insertionnelle.

Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K vues.  Temple University.  Ce protocole décrit la méthode de piégeage de gènes mutagenèse insertionnelle utilisant Gal4-VP16 comme le journaliste primaire et GFP / DP en tant que reporters secondaires chez le poisson zèbre. Environ une personne sur dix co-exprimant haut exprimant F0 gène de rendement de piège à poissons progéniture GFP et DP. La procédure de criblage peut être facilement mis à l'échelle pour s'adapter à la taille du laboratoire effectuant l'écran de mut...

Vidéo: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Recherche

Biologie

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage poisson zèbre pour adultes

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...