Les changements métaboliques dans les cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre leur permettent de passer de leur état de quiescent à un état de différenciation pour soutenir des demandes de formation de sang. L’altération de la plasticité métabolique des cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre mène aux désordres hématologiques. Notre protocole aidera à mesurer la régulation métabolique et la santé des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pendant le développement sanguin et les maladies.
L’analyse de la respiration mitochondrique et de la glycolyse des cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre est difficile car elles sont la population fragile et rare. Notre protocole optimisé permet l’isolement d’une plus grande quantité de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse murine, améliore leur viabilité pendant l’incubation, facilite l’analyse du flux extracellulaire des HSPC non adhérents et fournit des paramètres d’injection optimisés pour la phosphorylation oxydative ciblant les médicaments ainsi que les voies glycolytiques. Pour commencer cette procédure, remplissez les puits de la plaque d’utilité et les chambres autour des puits avec de l’eau stérile.
Submergez la cartouche du capteur dans la plaque d’utilité en vous assurant que les capteurs sont complètement recouverts d’eau. Placez ensuite la cartouche immergée dans la plaque d’utilité dans un incubateur non CO2 à 37 degrés Celsius pour incuber pendant la nuit. Dans une armoire de biosécurité de classe II, ajouter 40 microlitres de solution PLL disponible dans le commerce à chaque puits de la plaque d’essai.
Couvrir la plaque d’essai avec le couvercle fourni dans le kit et incuber la plaque fermée à température ambiante sous le capot pendant une heure. Après cela, utilisez un aspirateur stérile à base de vide pour enlever la solution excédentaire et sécher à l’air la plaque sous le capot. Pour récolter les cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajouter cinq millilitres de gradient de densité moyen à un tube conique de 15 millilitres.
Ajouter lentement cinq millilitres de la suspension cellulaire de la moelle osseuse en s’assurant que les cellules restent comme une couche au-dessus du milieu de gradient de densité. Centrifugeuse à 500 fois g et à température ambiante pendant 30 minutes en s’assurant que la centrifugeuse est à la plus faible accélération possible. Récoltez l’interface moyenne des cellules mononucléées dans un tube frais de 15 millilitres.
Ensuite, lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS contenant 2%FBS. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Enlevez le supernatant et resuspendez les cellules dans 300 microlitres de 1X PBS contenant 2%FBS.
Ensuite, aliquot 10 microlitres de la suspension cellulaire pour un contrôle non taché ou unicolore dans un tube FACS. Pour récolter les HSPCs LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajoutez 15 microlitres de cocktail d’anticorps biotine à 300 microlitres de cellules de moelle osseuse mononucléées. Pour récolter les HSPCs LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajoutez 15 microlitres de cocktail d’anticorps biotine à 300 microlitres de cellules de moelle osseuse mononucléées.
Placer les tubes dans un seau à glace placé sur un shaker dans un réfrigérateur pour incuber à quatre degrés Celsius avec agitation pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 10 millilitres de 1X PBS pré-refroidi contenant 2% de FBS aux cellules. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 400 microlitres de 1X PBS contenant 2%FBS. Vortex brièvement les microbilles anti-biotine avant utilisation. Ajouter 80 microlitres des microbilles à chaque échantillon et bien mélanger.
Incuber pendant 20 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius avec agitation. Après cela, ajouter 10 millilitres de PBS pré-réfrigéré contenant 2%FBS aux cellules. Centrifuger le tube à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS contenant 2%FBS. Rangez la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius tout en installant l’unité de séparation magnétique. Placez la colonne dans un champ magnétique pour le séparateur de tri des cellules magnétiques assistées à quatre degrés Celsius.
Préparez la colonne pour la séparation magnétique en la rinçant avec trois millilitres de 1X PBS contenant 2%FBS sous flux de gravité à quatre degrés Celsius. Ajouter la suspension cellulaire à la colonne pré-humide à quatre degrés Celsius. Laissez toutes les cellules traverser la colonne à quatre degrés Celsius et recueillez les effluents dans un tube conique de 15 millilitres.
Ensuite, lavez la colonne avec trois millilitres de 1X PBS et 2%FBS à quatre degrés Celsius. Répétez ce lavage trois fois. Recueillir le flux à travers et le garder à quatre degrés Celsius.
Centrifugeuse le tube conique contenant le flux à travers à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en 0,5 millilitres de 1X PBS avec 2%FBS et transférez la suspension dans un tube FACS. Ajouter ensuite 24 microlitres du cocktail d’anticorps LSK à chaque tranche de 10 millions de cellules.
Couvrir le tube de papier d’aluminium et incuber dans l’obscurité à quatre degrés Celsius avec agitation pendant une heure. Après cela, ajouter trois millilitres de 1X PBS avec 2%FBS au tube FACS. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez les cellules étiquetées anticorps en un millilitre de 1X PBS contenant 2%FBS. Juste avant le tri, ajouter un microlitre d’un milligramme par millilitre d’iodure de propidium à la suspension cellulaire et utiliser une passoire de 40 micromètres pour filtrer le contenu du tube FACS. Tout d’abord, centrifugeuse les cellules LSK recueillies à 500 fois g et à température ambiante pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et résépendez les cellules dans un média complet à une concentration finale d’au moins 70 000 cellules par 40 microlitres. Ensemencer 40 microlitres de cette suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de huit puits recouverte de PLL en s’assurant de laisser tous les puits d’angle vides. Centrifuger la plaque à 450 fois g et à température ambiante pendant une minute.
Utilisez un microscope inversé pour vous assurer que les cellules sont fixées au fond des puits. Après cela, ajouter 135 microlitres de supports complets aux cellules de chaque puits, ce qui porte le volume final de chaque puits à 175 microlitres. Ajouter 175 microlitres de supports complets aux deux coins de la plaque sous forme de blancs.
Incuber les cellules dans un incubateur non CO2 à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, mettre en place un programme pour l’analyseur d’ajouter des médicaments à chaque puits de la plaque tel que décrit dans le tableau deux et le tableau trois du protocole texte. Pour le test de résistance mitochondrial, récupérer la cartouche de capteur dans la plaque d’utilité de l’incubateur de sorte que chaque puits a une concentration finale de deux oligomycine micromolaire, 1,5 micromolaire FCCP, et 0,5 micromolaire de rotenone et anti-mycine A au besoin.
Retirez le couvercle de la cartouche du capteur et placez-le sur le plateau de l’instrument. Commencez le processus d’étalonnage qui prendra 20 minutes. Lorsque l’étalonnage est terminé, retirez la plaque utilitaire et remplacez-la par la plaque d’analyse contenant les cellules LSK.
Appuyez sur continuer à démarrer le programme précédemment défini. Lorsque le programme est terminé, récupérez les données et analysez-les. Dans cette étude, une quantité maximale de HSPCs viables de LSK de murine sont isolés et leur métabolisme glycolyse et mitochondrique est mesuré avec un analyseur de flux extracellulaire.
Bien que l’analyse du flux extracellulaire soit traditionnellement utilisée pour les cellules adhérentes, cette méthode rend les HSPC LSK adhérents aux puits enduits de PLL, ce qui permet de mesurer le flux extracellulaire et donc la santé métabolique des HSPCs LSK. Afin de mesurer la respiration mitochondrique par le taux de consommation d’oxygène et la glycolyse par le taux d’acidification extracellulaire dans des conditions basales et de stress, les médicaments qui interfèrent avec la glycolyse et la respiration mitochondrique sont injectés séquentiellement. Comme prévu, le niveau basal du taux d’acidification extracellulaire est plus élevé pour les HSPCs de LSK cultivés dans le glucose et pyruvate les médias positifs comparés à ceux cultivés dans les médias négatifs.
L’injection de glucose n’a pas changé le taux d’acidification extracellulaire pour les cellules cultivés dans les médias positifs, mais elle a stimulé la glycolyse des cellules dans les médias négatifs. Cependant, le niveau basal de ces cellules est resté plus bas dans le groupe positif. L’injection avec l’oligomycine a activé la glycolyse à son niveau maximum dans le groupe positif, mais n’a pas affecté le groupe négatif.
L’injection avec l’analogue de glucose à 2-DG a retourné le taux d’acidification extracellulaire aux niveaux non glycolytiques. Pour le test de stress mitochondrial, l’injection d’oligomycine hyperpolarisé la membrane mitochondriale empêchant plus de pompage de protons à travers les complexes ETC et réduisant ainsi le taux de respiration mitochondriale. L’injection de FCCP pousse le taux de consommation d’oxygène au maximum pendant que les cellules essayent de récupérer le potentiel mitochondrique de membrane.
L’injection avec deux autres inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons provoque l’arrêt complet de la respiration mitochondriale et donc le taux de consommation d’oxygène est revenu à son niveau minimum. S’il vous plaît éviter l’utilisation de tampon de lyse de globule rouge pour l’isolement cellulaire mononucléaire. Nous recommandons la séparation du gradient Ficoll pour empêcher la formation de touffes et réduire la perte de LSK.
En utilisant notre méthode optimisée, nous pouvons mesurer la respiration mitochondrique et la glycolyse des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques rares et fragiles et l’étude des indices métaboliques régulent l’hématopoïèse normale et maligne.
