Ce protocole montre un guide étape par étape pour mesurer la rigidité des hydrogels et des cellules à l’aide d’un nanopénétrateur disponible dans le commerce et présente également un logiciel open source pour analyser de manière reproductible les données acquises. Le protocole nous permet d’obtenir des données de type microscopie à force atomique, cependant, à une fraction de la complexité. Ce protocole sera donc utile pour les scientifiques intéressés par l’étude des propriétés mécaniques d’échantillons sains et malades, mais nous pensons également qu’il sera d’une application plus large dans le contexte de la nanoindentation pour les matériaux mous.
Après avoir allumé l’instrument et monté la sonde sélectionnée pour l’expérience, commencez à étalonner la sonde. Cliquez sur Initialiser dans la fenêtre principale du logiciel. Dans le menu Calibration (Calibration) qui s’affiche, entrez les détails de la sonde dans les zones de saisie.
Ensuite, remplissez une boîte de Petri en verre épais avec un fond plat avec le même milieu que la boîte d’échantillon et faites correspondre la température du milieu avec celle de l’échantillon. Ensuite, placez le plat d’étalonnage sous la sonde. Pour l’étalonnage dans un liquide, prémouiller la sonde avec une goutte d’éthanol ou d’isopropanol à 70% avec l’extrémité de la pipette en contact léger avec la virole en verre, de sorte que la goutte glisse sur la pointe cantilever et sphérique.
Ensuite, faites glisser manuellement le bras du nanopénétreur vers le bas jusqu’à ce que la sonde soit complètement immergée, mais toujours loin du fond de la boîte de Pétri. Attendez cinq minutes pour permettre d’atteindre les conditions d’équilibre dans le liquide. Ensuite, dans le menu Initialiser du logiciel, cliquez sur Scan Wavelength.
L’écran de l’interféromètre affichera une barre de progression. Vérifiez si le balayage optique a réussi en accédant au panneau Balayage de longueur d’onde du boîtier de l’interféromètre. Ensuite, dans le menu Initialiser, cliquez sur Rechercher une surface pour abaisser progressivement la sonde.
La sonde cesse de bouger lorsqu’elle entre en contact avec la boîte de Petri en verre. Une fois que la sonde est en contact avec la surface, déplacez-la d’un micromètre vers le bas à l’aide du bouton flèche y vers le bas de la fenêtre principale du logiciel. Observez le signal vert dans la fenêtre en direct pour les changements dans la ligne de base à chaque pas d’un micromètre.
Ensuite, cliquez sur Calibrer dans le menu Initialiser. Lorsque l’étalonnage est terminé, vérifiez les anciens et les nouveaux facteurs d’étalonnage dans la fenêtre contextuelle affichée. Si le nouveau facteur d’étalonnage est dans la plage correcte, comme expliqué dans le manuscrit, cliquez sur Utiliser un nouveau facteur.
Ensuite, montez le piézo de 500 micromètres. Ensuite, vérifiez si le cercle de démodulation a été correctement calibré en accédant à l’onglet Démodulation sur le bureau de l’interféromètre. Tapotez doucement sur la table optique ou le nanopénétrateur pour induire suffisamment de bruit.
Un cercle blanc de points de données discrets devrait couvrir approximativement le cercle rouge. Chargez la boîte de Petri contenant l’échantillon sur la platine du microscope et déplacez manuellement la sonde du nanopénétrateur dans la position souhaitée au-dessus de l’échantillon. Faites glisser la sonde en solution, en prenant soin de laisser un à deux millimètres entre la sonde et la surface de l’échantillon.
Attendez cinq minutes que la sonde s’équilibre en solution. Concentrez-vous sur la sonde avec le microscope optique. Pour mesurer le module de Young des matériaux souples, cliquez sur Configurer l’expérience.
Ajoutez une étape de recherche de surface et une seule indentation dans le contrôle de déplacement pour déterminer les paramètres expérimentaux à utiliser ultérieurement pour le balayage automatique de la matrice. Si l’indentation unique réussit, configurez un balayage matriciel contenant 50 à 100 points espacés de 10 à 100 micromètres. Après vous être assuré que la case Recherche automatique de surface est cochée, cliquez sur Utiliser la position de la scène pour démarrer l’analyse matricielle à partir de la position actuelle de l’étape.
Configurez le profil de balayage matriciel dans le contrôle de déplacement. Laissez le nombre de segments à cinq et utilisez le profil de déplacement par défaut. Si nécessaire, modifiez le profil de déplacement et le temps pour chaque segment incliné.
Ne pas dépasser les vitesses de déformation supérieures à 10 micromètres par seconde. Enregistrez l’expérience configurée dans le chemin d’expérience souhaité. Cliquez sur Exécuter l’expérience et attendez qu’elle soit terminée.
Lorsque toutes les données sont acquises, nettoyez la sonde et éteignez l’instrument comme décrit dans le texte. Pour le criblage des courbes force-déplacement et la production d’un ensemble de données nettoyées au format JSON, préparez-vous. PY à partir de la ligne de commande sur l’ordinateur de laboratoire.
Sélectionnez le format de données Optics11 dans la liste déroulante. Si les données ne sont pas chargées correctement, relancez l’interface utilisateur graphique et sélectionnez Optics11 Old. Ensuite, cliquez sur Charger le dossier et sélectionnez un dossier contenant les données à analyser.
Nettoyez l’ensemble de données à l’aide des onglets présents à droite de l’interface utilisateur graphique. Ensuite, cliquez sur Enregistrer JSON et entrez un nom approprié pour l’ensemble de données nettoyé. Envoyez le fichier JSON à l’ordinateur sur lequel le logiciel NanoAnalysis a été installé, s’il est différent de l’ordinateur actuel.
Lancez le nano. PY à partir de la ligne de commande. En haut à gauche de l’interface utilisateur graphique, cliquez sur Load Experiment et sélectionnez le fichier JSON.
Cela remplira la liste des fichiers et le graphique des courbes brutes montrant l’ensemble de données en termes de courbes force-déplacement. Dans la zone Statistiques, vérifiez les valeurs des trois paramètres, N activé, N a échoué et N exclu. Pour visualiser une courbe spécifique plus en détail, cliquez sur la courbe.
Cela le mettra en surbrillance en vert et l’affichera sur le graphique de courbe actuel. Une fois qu’une seule courbe a été sélectionnée, les paramètres R et k seront renseignés dans la zone Stats. Une fois que l’ensemble de données a été nettoyé, filtrez tout bruit dans les courbes à l’aide des filtres implémentés dans la zone Filtrage.
Ensuite, inspectez les courbes filtrées dans le graphique de courbe courante. La courbe filtrée est en noir, tandis que la version non filtrée est verte. Pour trouver le point de contact, dans la zone Point de contact, choisissez l’une des procédures numériques implémentées dans le logiciel.
Ajustez les paramètres de l’algorithme en fonction de l’ensemble de données afin que le point de contact soit localisé correctement, comme expliqué dans le manuscrit. Pour voir où le point de contact a été trouvé sur une seule courbe, sélectionnez la courbe en cliquant dessus. Ensuite, cliquez sur Inspecter.
Vérifiez la fenêtre contextuelle qui apparaît pour identifier l’emplacement du point de contact. Ensuite, cliquez sur Analyse Hertz. Cela générera trois graphiques.
Vérifiez les données d’indentation de force pour chaque courbe de l’ensemble de données, ainsi que l’ajustement Hertz moyen indiqué en rouge. Ensuite, vérifiez la courbe d’indentation de la force moyenne avec une bande d’erreur montrant un écart type, ainsi que l’ajustement moyen en Hertz indiqué en rouge. Ensuite, vérifiez le nuage de points du module de Young provenant de l’ajustement du modèle de Hertz à chaque courbe individuelle.
Examinez la boîte Résultats pour le module de Young moyen calculé et son écart-type, et assurez-vous qu’ils sont raisonnables pour l’expérience donnée. Ensuite, dans la zone Enregistrer, cliquez sur Hertz. Dans la fenêtre contextuelle, entrez le nom du fichier et le répertoire, puis cliquez sur Enregistrer.
Un fichier tsv sera créé. Ouvrez le fichier tsv dans n’importe quel logiciel supplémentaire pour l’analyse statistique et le traçage ultérieur. Pour les données de nanoindentation cellulaire, cliquez sur Analyse des spectres d’élasticité.
Inspecter les deux diagrammes produits, à savoir le module de Young en fonction de la profondeur d’indentation pour chaque courbe et le module de Young moyen en fonction de l’indentation ajustée par un modèle bicouche. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur ES dans la case Enregistrer. Cela exportera un fichier tsv dans le répertoire spécifié, qui peut être ouvert et tracé dans n’importe quel autre logiciel de votre choix.
Une expérience réussie aboutit au segment d’approche d’une courbe force-déplacement, ayant une ligne de base claire et plate, une région de transition et une région inclinée. Les courbes montrant des altérations de cette forme sont facilement supprimées de l’ensemble de données à l’aide de NanoPrepare. Les courbes force-indentation moyennes ainsi que le modèle Hertz moyen pour un hydrogel de polyacrylamide souple et un hydrogel rigide sont présentés ici.
En traçant les valeurs individuelles du module de Young, le module de Young moyen attendu a été récupéré pour les deux hydrogels. Pour les expériences de nanoindentation cellulaire, la courbe force-indentation moyenne et le modèle Hertz moyen correspondant démontrent que le modèle Hertz ne capture pas complètement l’évolution de la force avec une profondeur d’indentation croissante pour les expériences de nanoindentation cellulaire. Les spectres d’élasticité moyens ajustés jusqu’à une indentation de 200 nanomètres sont démontrés ici.
Les spectres d’élasticité moyens commencent à augmenter à une profondeur d’indentation de 200 nanomètres, indiquant la contribution d’un substrat au module de Young apparent sondé. Pour cette raison, 200 nanomètres ont été choisis comme plage d’ajustement pour le modèle Hertz et le modèle bicouche. L’ajustement du modèle bicouche permet à l’extrait plus d’informations sur l’état mécanique de la cellule, y compris l’épaisseur du cortex d’actine cellulaire, le module du cortex d’actine cellulaire et le module de volume de la cellule, comme expliqué dans le texte principal.
Une comparaison directe entre le modèle de Hertz et l’approche des spectres d’élasticité en termes de distribution de module de Young révèle des distributions qui se chevauchent avec des moyennes comparables, démontrant la faisabilité de l’approche des spectres d’élasticité. Localiser avec précision le point de contact et maintenir la cohérence des paramètres de l’algorithme choisi entre les ensembles de données que l’on souhaite comparer est primordial pour obtenir des comparaisons fiables entre les échantillons. La méthode est d’application générale pour quantifier les propriétés élastiques locales des échantillons biologiques, y compris les sphéroïdes, les organoïdes, les tissus et, en général, toute la matière molle.
