Ce protocole a un impact élevé dans le domaine de la découverte et du développement de médicaments, en particulier dans le développement de nouveaux médicaments de première classe avec un minimum d’effets secondaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée à n’importe quel système GPCR, et utilisée pour obtenir des informations précises sur la pharmacologie des récepteurs dans les systèmes vivants en temps réel. Les implications de cette technique sont étroitement liées aux nouvelles thérapies particulièrement où les bêta-arrestins sont pertinents.
Il s’agit notamment des récepteurs opiacés dans la douleur et les récepteurs dopaminergiques dans la schizophrénie. Cette méthode peut être utile dans de nombreux domaines de recherche scientifique médicale, de la neurologie à la maladie cardiopulmonaire. La démonstration pcr de notre méthode est importante, car elle permet une présentation détaillée des étapes critiques du protocole, ce qui ne serait pas possible avec la publication conventionnelle.
Commencez par concevoir des amorces pour introduire des gènes d’intérêt pour les vecteurs pBiT. En raison du codon d’arrêt inframe qui divise le site de clonage multi, sélectionnez au moins un des trois sites comme l’une des deux enzymes de restriction uniques nécessaires pour le clonage directionnel. Se référer au manuscrit pour les séquences de nucléotides pour coder les résidus linker et les incorporer dans les amorces.
Pour le pBiT1.1-C et pBiT2.1-C assurez-vous que l’amorce avant contient un codon ATG et une séquence de consensus Kozak puissant. Pour le pBiT1.1-N et pBiT2.1-N assurez-vous que l’amorce inverse contient un codon stop. Utilisez les amorces conçues pour amplifier l’ADN d’insertion du gène d’intérêt.
Combinez les reagents PCR selon les instructions manuscrites, en vous assurant d’utiliser une polymése d’ADN haute fidélité pour minimiser les mutations. Programmez le thermocycleur et démarrez la réaction. Après avoir terminé la PCR, digérer le produit dans une réaction de digestion de 50 microlitres.
Dans un tube de 1,5 millilitre, combiner 12 microlitres d’eau distillée, cinq microlitres du tampon de digestion de restriction approprié de 10X, et 30 microlitres du produit PCR. Ajouter ensuite 1,5 microlitres de chaque enzyme de restriction. Vortex le mélange de réaction.
Et incuber toute la nuit à 37,5 degrés Celsius. Préparer une deuxième réaction pour digérer le plasmide receveur. Dans un tube de 1,5 millilitre, combiner 23 microlitres d’eau, cinq microlitres du tampon de digestion de restriction approprié de 10X, 15 microlitres du plasmide destinataire, et 1,5 microlitres de chaque enzyme de restriction.
Mélanger brièvement le tube. Et incuber toute la nuit à 37,5 degrés Celsius. Le lendemain du clonage et de la transformation, choisissez trois à dix colonies bactériennes individuelles et transférez-les à un millilitre de LB moyen avec ampicilline.
Incuber les cellules pendant six heures. Et puis transférer 200 microlitres de suspension bactérienne à cinq millilitres de milieu LB frais avec de l’ampicilline. Incuber la culture à 37,5 degrés Celsius avec des secousses à 200 rpm pendant la nuit.
Le lendemain, isolez le plasmide avec une mini-trousse de purification de l’ADN de préparation. Filtrez le plasmide purifié pour une ligature réussie avec PCR. Un jour avant la transfection, ensemencer les cellules d’une plaque de 96 puits recouverte de poly-L-lysine à l’aide du milieu modifié eagle de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités par millilitre de pénicilline G, et 100 microlitres par millilitre de streptomicine.
N’ajoutez que des cellules aux 60 puits intérieurs pour minimiser le potentiel de gradients thermiques à travers la plaque et les effets de bord de l’évaporation. Ajouter 200 microlitres d’eau distillée stérile aux 36 puits extérieurs et 150 microlitres dans les espaces entre les puits. Puis incuber la plaque pendant la nuit à 37,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, effectuez une transfection à l’aide d’un total de 100 nanogrammes d’ADN. Mettre en place quatre combinaisons de plasmides différentes selon les instructions manuscrites. Utilisation de 20 microlitres du média essentiel minimum d’Eagle modifié tamponné avec HEPES, et de 0,3 microlitres de réaccente de transfection lipidique par puits.
Ajouter 20 microlitres de réaccente de transfection lipidique et de mélange d’ADN à chaque puits, et mélanger la plaque en cercles pendant 10 secondes. Incuber la plaque à 37,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Rafraîchissez le milieu.
Et incuber encore 24 heures. Après l’incubation, aspirer le milieu et ajouter 100 microlitres de support essentiel minimum d’Eagle modifié tamponné avec HEPES à chaque puits. Laisser la plaque se stabiliser à température ambiante pendant 10 minutes.
Pendant ce temps, préparer le substrat de furimazine en combinant un volume du substrat 100X avec 19 volumes de tampon de dilution LCS, créant un stock 5X à mélanger avec le milieu de culture cellulaire. Lorsque les cellules sont prêtes, ajouter 25 microlitres du bouillon à chaque puits, et mélanger délicatement la plaque pendant 10 secondes. Ensuite, mesurez la luminescence pendant 10 minutes à température ambiante pour la stabilisation du signal.
Pour des expériences avec l’addition de ligand, préparez la solution ligand de 13.5X dans le média essentiel minimum modifié d’Eagle tamponné avec HEPES, et ajoutez 10 microlitres par puits utilisant une pipette multicanal. Mélangez ensuite la plaque à la main ou à l’aide d’un shaker orbital. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier les interactions entre un GPCR prototypique et deux isoformes bêta-arrestin.
Quatre combinaisons plasmides différentes ont été examinées, et celle avec le signal luminescent le plus élevé a été choisie pour d’autres expériences. Les valeurs EC50 pour chaque isoforme bêta-arrestine ont été déterminées à l’aide de courbes dose-réponse, qui ont été obtenues à partir de la réponse maximale de chaque concentration à partir d’études cinétiques. Il est essentiel d’accorder une attention particulière lors de la conception des amorces PCR.
Le développement des bonnes constructions est essentiel au succès de ces analyses. En suivant cette méthodologie, vous serez en mesure de surveiller les interactions récepteur-bêta-arrestine, ainsi que les interactions des récepteurs avec d’autres protéines cytosoliques. Cette méthodologie aidera à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la pharmacologie GPCR en étudiant comment les interactions GPCR-beta-arrestin peuvent être modulées par des modifications de la structure ligand.
