Le protocole permet aux chercheurs de mesurer simultanément la réponse au calcium dans les cellules T primaires et d’évaluer leur sous-ensemble et leur phénotype de surface. Le principal avantage de cette technique est qu’elle évite d’avoir à isoler des sous-ensembles spécifiques de cellules avant d’examiner leurs réponses au calcium. Pour commencer, préparez une solution mère d’Indo-1 AM d’un microgramme par microlitre en ajoutant 50 microlitres de DMSO dans un flacon contenant 50 microgrammes d’Indo-1 AM. Diluer la solution mère dans un volume approprié de cRPMI et une concentration de six microgrammes par millilitre.
Placez le milieu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez ce milieu pour diluer une suspension cellulaire préalablement préparée à un rapport de un à un pour obtenir cinq à 6 millions de cellules par millilitre. Ensuite, sur une plaque de culture tissulaire de 12 puits, ajoutez un millilitre de suspension cellulaire par puits par condition expérimentale.
Préparer un seul échantillon témoin coloré pour l’Indo-1 sans calcium en ajoutant de l’EGTA aux cellules chargées de colorant Indo-1. Préparer un puits pour le contrôle biologique négatif sans fluorophores ni colorant Indo-1. Préparer un témoin positif Indo-1 en ajoutant de l’ionomycine à une concentration de 50 micromoles à la suspension cellulaire chargée de colorant au cytomètre en flux.
De plus, préparez un puits pour les contrôles de taches uniques pour des populations cellulaires supplémentaires en utilisant des fluorophores conjugués d’anticorps. Ajoutez ensuite deux microgrammes d’anticorps bloquant les récepteurs FC par million de cellules et incuber la plaque pendant 45 minutes en tapotant toutes les 15 minutes pour remettre les cellules en suspension. Après l’incubation, mélangez et retirez tout le volume de cellules de la plaque et ajoutez-le à des tubes microcentrifuges de 1,7 millilitre.
Centrifuger et décanter le surnageant. Une fois les cellules lavées avec un millilitre de cRPMI préchauffé, pelletez à nouveau et décantez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de cRPMI et incuber chaque tube, en laissant le haut du tube légèrement ouvert pour l’échange gazeux, permettant une deestérification complète des esters AM intracellulaires.
Ensuite, préparez un mélange principal de tous les anticorps conjugués fluorochromes définis par l’utilisateur et ajoutez-le aux cellules au repos pour un millilitre du volume cellulaire. Après le repos, pelleter les cellules et laver la pastille en la remettant en suspension dans un millilitre de cRPMI refroidi à quatre degrés Celsius. Répétez cette étape et placez les tubes sur de la glace.
Resuspendre des échantillons individuels dans 500 microlitres de cRPMI sans phénol rouge à l’aide d’un tube d’écoulement en polystyrène de cinq millilitres muni d’un bouchon. Pour maintenir la température à l’aide de l’analyse du flux de calcium, préparez un bain de perles en ajoutant des perles de bain à un petit bain-marie et réchauffez-le à 37 degrés Celsius. Coupez soigneusement un tube chronique de 50 millilitres en deux et jetez le dessus du tube.
Remplissez les trois quarts du tube restant avec des perles de bain et laissez-le atteindre 37 degrés Celsius dans le bain de perles. Placez le bain de billes près d’un cytomètre en flux, ainsi qu’un support en polystyrène pour positionner le tube. Avant l’analyse sur le cytomètre en flux, réchauffez les tubes individuellement à 37 degrés Celsius pendant sept minutes.
Connectez-vous au logiciel de cytomètre en flux et cliquez sur l’onglet Bibliothèque. Sélectionnez ensuite des étiquettes fluorescentes pour ajouter de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium. Sélectionnez ensuite Laser UV sous les groupes de balises fluorescentes et cliquez sur Ajouter pour ajouter un nom d’étiquette fluorescente.
Choisissez l’excitation laser et la longueur d’onde d’émission, puis cliquez sur Enregistrer. Passez à la configuration expérimentale. Cliquez sur l’onglet Acquisition, Ouvrir/Créer une nouvelle expérience et ajouter les balises fluorescentes souhaitées à l’expérience.
Créez un groupe de référence et un nouveau groupe d’échantillons pour l’expérience et étiquetez les deux groupes. Sous l’onglet Acquisitions, définissez les événements pour enregistrer au maximum à 10 millions, le volume d’arrêt au volume maximal de 3000 microlitres et le temps d’arrêt au maximum de 36 000 secondes. Acquérir des témoins à coloration unique pour les anticorps conjugués définis par l’utilisateur inclus dans le panneau multicolore et pour le colorant fonctionnel Indo-1.
Ajouter 50 micromoles d’ionomycine au contrôle positif Indo-1 lié au calcium et au vortex. Ajoutez le tube d’écoulement à la carte d’injection d’échantillon et cliquez sur Enregistrer. Ajoutez ensuite un contrôle négatif Indo-1 sans calcium au cytomètre en flux et cliquez sur Enregistrer.
Annulez le mélange des commandes colorées simples en cliquant sur le bouton Unmix. Une fois le démélange terminé, créez des tracés séquentiels à l’aide de la feuille de calcul non mélangée, comme SSC-A par rapport à FSC-A, pour enlever les débris de l’échantillon et SSC-A par rapport à SSC-H pour enlever les doublets. Créez ensuite des portes en cliquant sur Plot.
Ajoutez un tracé à la feuille de calcul et double-cliquez à l’intérieur de la porte pour créer une population fermée en aval. Continuez jusqu’à ce que toutes les populations d’intérêt soient prises en compte. Ensuite, réchauffez les échantillons témoins colorés à une seule couleur préalablement préparés à 37 degrés Celsius pour une analyse séquentielle.
Configurez le logiciel de cytométrie en flux et exécutez DI dans de l’eau glacée pendant deux à trois minutes pour assurer la stabilité fluidique du cytomètre en flux. Configurez des tracés séquentiels sur la feuille de calcul non mélangée en créant des portes à l’aide du rectangle polygonal ou des boutons de porte elliptique pour inclure la population d’intérêt. Double-cliquez à l’intérieur de la porte et remplacez les paramètres des axes y et x par SSC-A par rapport à SSC-H.
Terminez la définition des paramètres de l’axe en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur l’axe. Créez un tracé avec le signal de colorant SSC-A par rapport au colorant de viabilité. Fermez les cellules vivantes qui sont négatives pour la coloration au colorant amine.
Les cellules vivantes négatives pour la coloration vivante morte se regrouperont à la marque zéro sur les axes y et x. Double-cliquez sur le graphique intérieur pour créer un nouveau graphique contenant uniquement des lymphocytes vivants unicellulaires. Changez l’axe des Y en Indo-1 en fonction du temps sur l’axe des x pour visualiser l’afflux de calcium.
Ensuite, placez l’échantillon biologique chauffé dans le SIT de la machine. Exécutez les échantillons à 2 500 à 3000 événements par seconde sur un débit moyen pour visualiser l’afflux de calcium dans un nombre limité de populations cellulaires. Ajouter le tube suivant au bain de billes dans le contrôle d’acquisition.
Appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les données initiales pendant 30 secondes afin d’obtenir un niveau basal de signalisation calcique dans l’échantillon. Cliquez ensuite sur Arrêter et retirez le tube de l’orifice d’injection de l’échantillon. Ajouter 30 microgrammes d’anti-CD3 non conjugué directement dans le tube à échantillon pour initier l’afflux de calcium.
Replacez rapidement le tube sur le port d’injection de l’échantillon et appuyez sur Enregistrer dans le logiciel. Enregistrez les données pendant sept minutes, en regardant le temps écoulé sous les contrôles d’acquisition du logiciel. Appuyez ensuite sur Arrêter dans le logiciel.
Ajouter un microgramme par millilitre d’ionomycine et enregistrer pendant 30 secondes pour obtenir le signal de calcium maximal dans les cellules d’intérêt. Passez à l’échantillon suivant et répétez le workflow jusqu’à ce que tous les échantillons aient été collectés. Enregistrez l’expérience et cliquez sur le fichier zip d’exportation.
Les fichiers non mélangés sont téléchargés vers un logiciel externe d’analyse de cytométrie en flux. Un signal stable et cohérent dans un tracé de la diffusion temporelle par rapport à la diffusion latérale indiquait une stabilité fluidique. La population lymphocytaire a été fermée, suivie d’une discrimination des singulettes sur une parcelle de hauteur de dispersion latérale par rapport à la surface.
La viabilité des singulettes a été évaluée. Ensuite, un point de contrôle sur la population CD19 négative a été appliqué. Ces sous-ensembles de lymphocytes T ont été évalués à l’aide d’anticorps dirigés contre CD4 et CD8 en visualisant la fluorescence Indo-1 liée au calcium en fonction du temps.
Dans les populations cellulaires individuelles, le graphique de l’Indo-1 lié au calcium en fonction du temps a montré une ligne de base avant la stimulation. Une réponse maximale lorsque les niveaux de calcium intracellulaire ont diminué et la réponse calcique a été provoquée par l’ajout d’ionomycine. Avant l’ajout d’anticorps anti-CD3, un faible signal Indo-1 lié au calcium a été détecté.
Au cours de la réponse maximale, les cellules ont montré un fort signal Indo-1 lié au calcium et une réduction de l’Indo-1 sans calcium. Cinq minutes après le pic, la fluorescence Indo-1 est presque revenue à la ligne de base. Après l’ajout d’ionomycine, un signal robuste d’Indo-1 lié au calcium a été visualisé, indiquant une charge de colorant adéquate des cellules.
L’analyse des populations rares a été effectuée en traçant l’Indo-1 lié au calcium par rapport à l’Indo-1 sans calcium après avoir été mis en évidence sur chaque population d’intérêt. Et analyser la réponse calcique sur l’ensemble du parcours temporel pour chaque sous-ensemble. Le flux de calcium à l’aide du profilage à spectre complet peut conduire à une analyse cytométrique en flux à paramètres élevés dans divers sous-ensembles immunitaires.
L’analyse de haute dimension pour le regroupement non biaisé de sous-ensembles de lymphocytes T peut être utilisée en combinaison avec la cytométrie de flux à paramètres élevés pour une analyse avancée. Cette technique est développée pour l’analyse de plusieurs sous-ensembles immunitaires en conjonction les uns avec les autres dans un échantillon global.
