0.Notre protocole décrit une méthode optimisée et reproductible pour générer de l’ostéoclaste in vitro qui peut être utilisée pour étudier les mécanismes sous-jacents à leur processus de différenciation et à leur fonctionnalité. Le principal avantage de cette technique est la capacité de générer un nombre élevé d’ostéoclastes fonctionnellement actifs en seulement une semaine. Un rendement de différenciation élevé est obtenu en utilisant des monocytes purifiés et en ajoutant des cytokines à temps.
Les ostéoclastes sont responsables de la destruction osseuse dans toutes les formes d’arthrite, et cette méthode fournit les outils pour cribler de nouveaux composés thérapeutiques qui peuvent moduler leur différenciation et / ou leurs fonctions. Patricia Riedlova, doctorante de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, isolez les PBMC en transférant le sang dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Diluez-le avec du PBS stérile dans un volume égal pour le sang frais, ou un rapport de 1:3 pour les cônes leucocytaires et les manteaux leucocytaires. Mélanger délicatement le sang par inversion. Préparez des tubes de 15 millilitres contenant trois millilitres de milieu de gradient de densité et déposez lentement huit à 10 millilitres de sang dilué sur le dessus du milieu de gradient de densité, en évitant de mélanger.
Centrifuger le tube à 400 x g pendant 30 minutes à température ambiante sans frein. Ensuite, jetez soigneusement la couche supérieure avec une pipette Pasteur. Recueillez la couche interphasée inférieure contenant les PBMC et transférez cette couche dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Suspendre les cellules jusqu’à 50 millilitres avec du PBS stérile et laver le milieu de gradient de densité résiduelle en centrifugeant à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante avec le frein à fond. Pour éliminer les plaquettes résiduelles, répétez le processus de centrifugation décrit dans le manuscrit, remettez en suspension les PBMC isolés et purifiés dans 20 millilitres de PBS et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre en suivant la méthode standard. Pour enrichir les monocytes CD14+, transférer 1 x 10 aux septièmes PBMC dans un tube à fond rond en polystyrène approprié et enduire les cellules à 300 x g pendant cinq minutes.
Après avoir jeté le surnageant et remis en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de séparation cellulaire, incuber les cellules avec 10 microlitres de cocktail d’anticorps par 100 microlitres avec le couvercle pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 10 microlitres de billes de nanoparticules magnétiques par 100 microlitres et incuber pendant trois minutes avec le couvercle. Complétez le volume à 2,5 millilitres avec le tampon de séparation cellulaire.
Placez le tube dans un aimant et incuber pendant trois minutes avec le couvercle enlevé. Maintenant, jetez la population de cellules négatives avec un mouvement continu par inversion alors que le tube est encore dans l’aimant. Retirez le tube de l’aimant, Lavez les monocytes CD14+ enrichis attachés aux billes magnétiques en les remettant en suspension dans 2,5 millilitres du tampon de suspension cellulaire et replacez le tube dans l’aimant.
Comptez les cellules isolées comme démontré précédemment. Centrifuger les cellules collectées à 300 x g pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant, remettre les cellules en suspension à 1 million de cellules par millilitre dans un milieu essentiel alpha minimum complet avec 10% FBS.
Pour différencier l’ostéoclaste, ajouter du M-CSF à une concentration finale de 25 nanogrammes par millilitre à la suspension cellulaire et mélanger en pipetant soigneusement pour homogénéiser la suspension cellulaire. Plaque de 100 microlitres de suspension par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’eau distillée stérile par puits autour des cellules plaquées pour éviter l’évaporation du milieu et les effets de bord dans le système de culture.
Incuber les cellules pendant la nuit pendant environ 18 à 20 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Préparer des milieux frais complétés par du M-CSF et du ligand RANK. Après l’incubation, retirer délicatement la moitié du milieu par aspiration à l’aide d’une pipette P200 et la remplacer par un milieu complet frais et chaud complété par du M-CSF et du ligand RANK à une concentration finale de 25 nanogrammes par millilitre.
Différencier les cellules en ostéoclastes pendant sept à 14 jours avec un remplacement complet du milieu tous les trois jours. Après avoir retiré le milieu, fixez les ostéoclastes adhérents différenciés avec 100 microlitres par puits de la solution fixatrice préparée et incuber pendant une minute. Ne touchez pas le fond des puits pour éviter de rayer les cellules adhérentes.
Une fois les puits lavés trois fois avec 300 microlitres d’eau distillée stérile, séchez les plaques et ajoutez 100 microlitres de solution de coloration fraîchement préparée à chaque puits. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 20 minutes. Après l’incubation, retirer la solution de coloration par inversion et laver la plaque trois fois avec 300 microlitres par puits d’eau distillée.
Enlevez l’excès d’eau en tapotant les assiettes sur des serviettes en papier et laissez les assiettes ouvertes et protégées de la lumière à l’air pendant la nuit. À l’aide d’un microscope à fond clair avec une option de tuiles, prenez des images à 10x ou 20x pour capturer toute la surface du puits. Comptez manuellement les ostéoclastes identifiés comme des cellules colorées TRAP+violet avec plus de trois noyaux à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images avec un plugin de compteur de cellules.
Plaquer 100 microlitres des monocytes CD14+ isolés par puits dans une lame de chambre de 18 puits à une densité cellulaire de 1 x 10 jusqu’à la cinquième cellule par puits. Différencier les ostéoclastes en présence de M-CSF et de ligand RANK comme démontré précédemment avec un changement complet de milieu tous les trois jours. À la fin, retirez doucement le milieu et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres de PBS préchauffé à pH 7,4.
Ne laissez pas les puits sécher entre les étapes. Fixer l’échantillon avec 100 microlitres par puits de solution de formaldéhyde à 4% dans du PBS et incuber pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital en agitant doucement. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres par puits de PBS.
Perméabiliser les cellules avec 100 microlitres par puits de solution de Triton x-100 à 0,1% diluée dans du PBS et incuber pendant 10 minutes comme indiqué précédemment. Laver deux fois avec 200 microlitres par puits de PBS. Pour bloquer la liaison non spécifique et augmenter le signal, ajoutez 100 microlitres de solution de blocage à base d’albumine sérique bovine à 2% et de solution PBS.
Incuber pendant 20 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital en agitant doucement. Après avoir retiré la solution de blocage, ajouter 100 microlitres de solution de phalloïdine conjuguée par fluorescence diluée dans une solution BSA/PBS à 2 % dans chaque puits. Laver deux fois avec 200 microlitres par puits de PBS.
Colorer les noyaux avec 100 microlitres par puits d’une solution de PBS contenant 300 nanomolaires DAPI. Après 10 à 15 minutes, retirez la solution DAPI et remplacez-la par du PBS de 100 microlitres par puits. Visualisez la coloration à l’aide d’immunofluorescence appropriée ou de microscopes confocaux à quatre à 40x.
Les ostéoclastes matures sont définis comme des cellules nucléées multiples TRAP+. L’ajout du ligand RANK a produit un nombre croissant de grands ostéoclastes TRAP+multinucléés de manière dose-dépendante. La cinétique de la différenciation des ostéoclastes des monocytes a été étudiée sur une période de culture de deux à 14 jours.
Les ostéoclastes multinucléés étaient visibles dès le cinquième jour, et une différenciation optimale a été atteinte le septième jour. La différenciation des ostéoclastes sur des surfaces minéralisées permet d’évaluer leur activité de résorption en analysant la formation de trous ronds, ou fosses de résorption. Le pourcentage de résorption augmente significativement en présence de M-CSF et de ligand RANK par rapport au M-CSF seul.
De plus, le traitement à la roténone en fonction de la dose a inhibé la résorption de la surface minéralisée par rapport au puits témoin non traité. L’inhibition roténone-dépendante de la résorption des ostéoclastes était associée à l’inhibition de la production d’ATP. La fragmentation de l’anneau actine dérivé du ligand RANK de l’OCS mature a été observée en présence de roténone.
Il est important de s’assurer que les monocytes enrichis ne contiennent pas de plaquettes, que les cellules sont plaquées à la bonne densité et que les puits environnants sont remplis d’eau pour éviter l’effet de bord. Ce protocole est particulièrement utile pour interroger mécaniquement comment les ostéoclastes se forment et ce qui influence leur fonctionnalité à la fois en science fondamentale et translationnelle. Par exemple, en utilisant des composés ou des protéines qui peuvent moduler ces processus.
