Dans ce protocole, les cellules monocytes-macrophages de la moelle osseuse sont extraites par une méthode d’adhérence secondaire. Les cellules monoculo-macrophages de la moelle osseuse peuvent se différencier avec succès en ostéoclastes, ce qui fournit un modèle cellulaire stable pour l’étude des ostéoclastes in vitro. Cette méthode convient aux petits échantillons de moelle osseuse et peut extraire les cellules de monocytes-macrophages de la moelle osseuse simplement et rapidement sans nécessiter d’équipement de laboratoire de haute technologie.
L’augmentation des ostéoclastes peut être la pathogenèse potentielle de l’ostéoporose. Les cellules monoculo-macrophages de la moelle osseuse ont une certaine valeur de recherche en tant que cellules précurseurs d’ostéoclastes. Pour commencer, immergez les rats euthanasiés dans de l’alcool à 75% pendant 10 minutes pour les désinfecter.
Après avoir soigneusement retiré tous les membres du rat avec des ciseaux et des pinces, aspirez avec du PBS à l’aide d’une pipette et rincez le sang adhérant aux membres. Puis à deux millilitres du DMEM FBS à 10% dans un tube de cinq millilitres. Après avoir transféré les os des membres dans le tube de cinq millilitres, utilisez des ciseaux pour couper les os des membres dans le tube en petits morceaux et mélangez l’homogénat pour remettre en suspension les cellules de la moelle osseuse dans le milieu de culture.
Rester debout pendant cinq minutes jusqu’à ce que les fragments de tissu se déposent au fond du tube. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de 10% FBS DMEM dans une antenne de culture de 100 millimètres, puis transférez le surnageant dans la boîte de culture. Incuber à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5% pendant environ 24 heures.
Après ce temps d’incubation, la majorité des cellules souches mésenchymateuses adhéreront à la paroi de la boîte de culture et se développeront lentement, tandis que la plupart des cellules monocytaires-macrophages de la moelle osseuse seront toujours en suspension dans le milieu de culture. Transférer la suspension cellulaire dans la boîte de culture de 100 millimètres dans une nouvelle fiole carrée de 25 centimètres et continuer à cultiver les cellules à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures supplémentaires. Après avoir retiré soigneusement l’ancien milieu, remplacez-le par un milieu frais après que les cellules monocytes-macrophages de la moelle osseuse ont adhéré à la paroi de la fiole.
La cytométrie en flux a montré que le pourcentage de cellules exprimant CD11b et c, un marqueur moléculaire à la surface des cellules de la lignée monocyte-macrophage, était d’environ 37,94% Avec la prolifération cellulaire continue, la majorité des cellules sont devenues plus grandes dans une forme irrégulière et se sont développées en un disque adhérent radial. Les résultats de la coloration TRAP ont montré que par rapport au groupe témoin, le nombre de granules rouge violet intracellulaires était significativement augmenté dans les cellules induites par l’activateur du récepteur du ligand kappa B du facteur nucléaire et du facteur stimulant les colonies de macrophages. L’analyse par transfert western a démontré que les niveaux d’expression des protéines spécifiques des ostéoclastes TRAP et de la cathepsine K étaient significativement augmentés dans les cellules traitées par rapport au groupe témoin.
La chose la plus importante dans cette procédure est le temps de collecter les cellules adhérentes secondaires dans 24 à 48 heures de culture primaire, les cellules monocytes-macrophages de la moelle osseuse commencent à adhérer complètement. Les cellules monocytaires-macrophages de la moelle osseuse isolées par cette méthode peuvent être induites en ostéoclastes in vitro, fournissant un modèle cellulaire stable pour l’étude de l’ostéoporose.
