Ce protocole décrit la fabrication de microtiges de gel qui s’interconnectent dans des échafaudages à micropores. Ces échafaudages peuvent être utilisés en combinaison avec des cellules fournissant l’espace nécessaire pour une interaction cellulaire efficace. Les deux différents types de micro-tiges de gel s’interconnectent au contact.
Au rapport d’aspect élevé conduit à des pores plus grands tout en maintenant la stabilité de l’échafaudage en utilisant moins de matériau synthétique par rapport aux micro-gels sphériques. Les échafaudages à micropores amélioreraient considérablement l’infiltration et l’interaction des cellules endogènes pour réparer les tissus endommagés. Les grands pores faciliteront la formation de vaisseaux sanguins pour échanger des nutriments vers les tissus en croissance.
La réduction du matériau échafaudé est bénéfique car plus d’espaces ouverts sont prévus pour la formation de tissus, ce qui est important pour les applications in vitro et in vivo. Un aspect critique est la technique microfitique sur chipulation. Pour assurer la production continue de micro-tiges de gel, le produit doit être transporté efficacement hors du tube sans colmatage.
Pour commencer, insérez les aiguilles dans les tubes en polyéthylène et retirez le gaz de la seringue et du tube. Insérez ensuite un tube en polyéthylène supplémentaire dans la sortie pour la collecte du produit. Ensuite, placez toutes les seringues en verre et les pompes à seringue et insérez chaque extrémité de tuyau dans l’entrée correspondante.
Ensuite, concentrez le microscope sur la section efficace huile-eau. Démarrez la première pompe à seringue d’huile pour remplir d’abord le canal avec de l’huile, afin d’éviter le mouillage du canal par la phase dispersée. Ensuite, diminuez le premier débit d’huile à 30 microlitres par heure et démarrez la pompe à seringue prépolymère jusqu’à ce que la phase aqueuse dispersée puisse être observée à la section transversale.
Ensuite, réglez le débit du prépolymère à 30 microlitres par heure et concentrez le microscope sur la sortie. Ensuite, démarrez la deuxième pompe à seringue d’huile et attendez que le régime d’écoulement soit stable. Placer le tube de sortie dans un récipient collecteur et régler le système d’irradiation UV de manière à ce que l’éclairement soit compris entre 900 et 1000 milliwatts par centimètre carré.
Et la tache d’irradiation est la partie du canal droit avant la sortie. Avant l’irradiation UV, régler les débits du prépolymère et de la première huile pour obtenir le rapport d’aspect souhaité dans la plage de 3,0 à 4,5, et régler le temps d’irradiation de la phase dispersée à environ 2,3 secondes, en fonction de la taille du point d’irradiation. Ensuite, commencez l’irradiation UV et, si nécessaire, ajustez à nouveau les débits en fonction de la sous-section précédente.
Ensuite, modifiez le conteneur de collecte et notez l’heure de début et les débits de la collection de produits. Pour terminer la collecte, retirez le conteneur de collecte en notant l’heure. Ensuite, arrêtez l’irradiation et toutes les pompes à seringues.
Ensuite, lavez le produit cinq fois avec du n-hexane, de l’isopropanol et de l’eau désionisée. Retirez ensuite le surnageant après sédimentation en bâtonnet. Transférer la première dispersion de composants dans un flacon transparent de 1,5 ou deux millilitres.
Ajoutez ensuite le deuxième composant de manière contrôlée en fonctionnement continu avec une pipette de 100 microlitres et mélangez le contenu directement à l’aide de la pipette pour absorber le liquide et l’ajouter à nouveau. Ajoutez ensuite la solution G R G D S P C à la structure interconnectée pour modifier tous les groupes époxy restants avec le peptide adhésif cellulaire portant une amine libre et du thyal et laisser à température ambiante pendant la nuit. Ensuite, retirez les molécules qui n’ont pas réagi en les lavant à l’eau désionisée et retirez le surnageant.
Après avoir réduit le niveau d’eau, ouvrir le flacon et éradier avec une lumière UV de longueur d’onde, 250 à 300 nanomètres. Fermez ensuite le flacon et transférez-le sur une banc propre. Ensuite, laver à l’eau stérile.
Remplacez l’eau dans le flacon par un milieu de culture cellulaire et laissez l’équilibre pendant cinq minutes. Ensuite, transférez l’échafaudage macro poreux dans une plaque de puits de culture cellulaire pour l’expérience en versant ou en utilisant une spatule. La microscopie confocale a révélé que la construction macroporeuse 3D était composée de micro-tiges de gel fonctionnalisées en amine et en époxy interconnectées.
La construction présente une géométrie compacte d’environ 10 000 micro-tiges de gel formées en deux ou trois secondes. Le module d’Effective Young des tiges de micro-gel amine et époxy ainsi que des sphères de micro-gel amine et époxy est mesuré par nano-indentation. Pour détecter les groupes fonctionnels actifs, le thiocyanate d’iso fluorescéine peut être utilisé pour visualiser les groupes aminés primaires et l’isomère de la fluorescéine amine peut être utilisé pour marquer les groupes époxy.
Les tiges de microgel amine ont des dimensions avec une longueur moyenne de 553 micromètres et une largeur moyenne de 193 micromètres dans l’eau désionisée, ce qui donne un rapport d’aspect d’environ 3,0. Les valeurs moyennes des macropores et des échafaudages composés de micro-tiges de gel sont de 100 micromètres, avec 90% des tailles de pores allant de 30 micromètres à plus de 150 micromètres. La sphère, comme les micro-gels, donne des amas avec des tailles de pores comprises entre environ 10 et 55 micromètres, avec une valeur moyenne d’environ 22 micromètres.
Les micro-tiges de gel décrites sont conçues pour produire des échafaudages à micropores interconnectés par mélange aléatoire. Une procédure de mélange contrôlé pourrait permettre la fabrication de géométries d’échafaudage plus adaptées à l’avenir. La rigidité des microgels et des indices biochimiques peut varier en fonction des exigences de vente.
En combinant différents blocs de construction, une grande variété de géométries et de propriétés peut être obtenue dans un échafaudage. De cette façon, nous pouvons cibler efficacement des cellules spécifiques pour former des tissus multicellulaires.
