Nous démontrons l’utilisation d’un outil d’apprentissage automatique supervisé par simulation pour analyser les mitochondries dans des images de microscopie fluorescente de cellules fixes. Les méthodes actuelles de segmentation des mitochondries dans les images de microscopie comprennent des méthodes basées sur le seuillage automatique telles que Ostu ou la segmentation manuelle. Les techniques basées sur le seuillage fonctionnent mal lorsque le rapport signal / arrière-plan est faible.
En règle générale, les images pour l’analyse morphologique présentent un grand nombre de mitochondries, ce qui rend la segmentation manuelle fastidieuse. Les méthodes d’apprentissage profond supervisées effectuent la segmentation avec une grande précision, mais nécessitent un grand nombre de données d’entrée de paires de vérité de terrain pour la formation. Cette approche utilise un simulateur basé sur la physique pour générer des paires d’images de microscopie et leur masque de forme de réalité de terrain 2D, éliminant ainsi le besoin d’annotation manuelle.
Le modèle formé sur des images simulées est ensuite utilisé pour segmenter les mitochondries en images réelles au microscope. Nous utilisons un outil de segmentation basé sur l’apprentissage profond qui permet l’automatisation de cette tâche avec une grande précision et qui ne nécessite pas d’ensemble de données annotées de réalité sur le terrain pour la formation. La simulation commence par la génération de la géométrie à l’aide de courbes paramétriques pour la génération de formes.
Les émetteurs sont uniformément répartis et placés aléatoirement sur la surface de la forme générée de sorte que la densité corresponde aux valeurs expérimentales. Une PSF 3D du microscope est calculée à l’aide du modèle Gibson-Lanni. Pour atteindre le photoréalisme entre les images simulées et les images expérimentales, nous imitons à la fois les bruits sombres et les bruits de prise de vue.
La réalité de terrain de la physique est générée sous la forme d’une carte binaire. Nous évaluons l’effet du traitement CCCP sur la morphologie mitochondriale de cardiommyoblastes fixes imagés à l’aide d’un microscope confocal. Culture cellulaire.
Préparer l’ensemencement des cellules, fonctionnant dans une hotte à flux laminaire stérile, en plaçant un couvercle pour chaque condition expérimentale dans un puits d’une plaque de 12 puits. Assurez-vous que la suspension cellulaire diluée est bien mélangée en pipetant le contenu du tube à centrifuger plusieurs fois de haut en bas avant de distribuer le volume approprié à chaque puits. Procédure expérimentale.
Aspirer les milieux de culture cellulaire des puits de la plaque de 12 puits, puis appliquer rapidement des milieux préchauffés frais sur les puits témoins et les milieux préchauffés avec une solution CCCP micromolaire aux puits de condition d’essai. Incuber dans l’incubateur de 37 cellules Celsius pendant deux heures. Aspirer les milieux de culture cellulaire des puits et appliquer la solution de fixation préchauffée.
Coloration et montage des cellules sur les lamelles de couverture. Ajoutez un support de montage de 10 microlitres à une lame de verre préparée pour monter un couvercle. Ramassez le bordereau de couverture de la plaque de 12 puits à l’aide d’une pince à épiler et tamponnez l’humidité des bordereaux de couverture en touchant brièvement le bord et l’arrière du bordereau de couverture à la serviette en papier non pelucheuse préparée.
Abaissez doucement le couvercle sur la gouttelette de support de montage en attente. Microscope et imagerie. À l’aide des oculaires, ajustez manuellement le niveau Z pour que l’échantillon soit mis au point.
Passez à l’onglet acquis dans le logiciel. Utilisez la configuration intelligente pour sélectionner le canal de fluorescence à utiliser pour l’imagerie. Array-centré sur le milieu du bordereau de couverture avec 12 positions totales à imager.
Position RA centrée sur le centre du bordereau de couverture. Il est possible d’imager plusieurs emplacements de manière automatisée. Génération de données d’entraînement simulées.
Téléchargez le code et décompressez le contenu. Suivez les instructions et le fichier readme pour configurer l’environnement. Accédez au dossier nommé src"Faire une copie ou utiliser le dossier 2.
mitochondria simulation airy » et renommez-le. Ce dossier contient tous les fichiers liés à la simulation des données d’entraînement. Il y a trois ensembles de paramètres à définir pour la simulation.
Tout d’abord, définissez les paramètres du nombre de mitochondries, de la plage de diamètre, de la plage de l’axe Z et de la densité des fluorophores pour le simulateur dans le fichier de configuration du lot. Ensuite, définissez les paramètres optiques de l’ouverture numérique, du grossissement et de la longueur d’onde minimale du jeu de données dans le fichier microscopePSFmode. py"Définissez la valeur souhaitée pour la taille des pixels et la longueur d’onde d’émission dans le generate_batch_parallel d’incendie.
py"Définissez le troisième ensemble de paramètres concernant le jeu de données de sortie, tels que la taille des images de sortie, le nombre de tuiles dans chaque image et le nombre total d’images dans le fichier generate_batch_parallel. py"Exécutez le fichier generate_batch_parallel. py"pour démarrer la simulation.
Pour obtenir l’image de taille finale, faites une copie du dossier nommé 5. Préparation des données et formation/préparation des données » et naviguez-y. Définissez les paramètres du numéro de lot et du nombre d’images par lot, de la plage de bruit à ajouter dans le fichier Data_generator.
py"Exécutez le fichier Data_generator. py"Créez les images de montage. Copiez les dossiers nommés image"et segment"dans le dossier datatrain/train ».
Segmentation basée sur le deep learning. Pour entraîner le modèle de segmentation pour un nouveau paramètre d’image de microscope, accédez au dossier nommé train"et définissez les paramètres de la taille de Bach, du modèle de base pour la segmentation, du nombre d’époques et du taux d’apprentissage pour l’entraînement dans le fichier nommé train_unet. py"Exécutez le fichier train_unet.
py"pour commencer la formation. Le processus d’apprentissage affiche la métrique permettant d’évaluer le modèle de segmentation sur le jeu de validation simulé. Une fois la formation terminée, le modèle est enregistré en tant que best_model.
h5"dans le dossier nommé train"Pour tester le modèle sur les images du microscope, les images doivent être divisées à la taille souhaitée par le modèle de train. Pour cela, accédez au dossier nommé 6. Préparer les données de test"et copier les fichiers au format PNG des données dans le dossier PNG"et exécuter le fichier split_1024_256.
py"Cela créera des recadrages de taille 256 par 256 des images dans le dossier de données. Pour segmenter les rognages d’images, accédez au dossier nommé 7. Testez la segmentation » et exécutez le fichier nommé segment.
py"après avoir défini le nom du modèle enregistré à utiliser. Les images segmentées sont enregistrées dans le dossier de sortie. Analyse morphologique.
Placez le fichier nommé make_montage. py"dans le dossier nommé 7. Testez la segmentation » et exécutez le fichier pour assembler la sortie segmentée à la taille d’origine de l’image.
Créez un nouveau dossier nommé 9. Analyse morphologique"dans le dossier source et naviguez dedans. Installez les bibliothèques skan et seaborn à l’aide de la commande pip install seaborn skan"Les masques de segmentation sont squelettés à l’aide de la bibliothèque nommée skan"pour permettre l’analyse de la topologie de la mitochondrie individuelle.
Placez le fichier dans le dossier 9. Analyse morphologique"Organisez les images des différents groupes de l’expérience dans différents dossiers à l’intérieur du dossier 7. Tester la segmentation"Exécutez le fichier pour créer des graphiques pour l’analyse. Résultats.
L’analyse quantitative à effectuer dépend des questions ou de l’hypothèse de recherche. Dans notre expérience, nous nous sommes intéressés aux trois morphologies différentes des mitochondries, à savoir les points « petits bits mitochondriaux, les bâtonnets « fibreux ou en forme de chaîne comme les mitochondries, et les réseaux multi ramifiés"Pour identifier la morphologie, nous squelettons d’abord la sortie de segmentation et analysons les liens de branche des différentes classes. Nous montrons les résultats de l’analyse pour les deux groupes de cellules adaptées aux galactoses, le groupe témoin et le groupe traité CCCP.
Nous constatons une augmentation significative de la longueur moyenne des branches des points, ce qui est attendu, étant donné le gonflement que subissent les mitochondries lorsqu’elles sont exposées au CCCP. Le pourcentage de mitochondries dans les longueurs individuelles des bâtonnets et des classes de réseau est significativement réduit par rapport au témoin lorsque les cellules ont été traitées avec CCCP, ce qui confirme notre hypothèse. Un scénario difficile pour notre méthode est lorsque l’image a des mitochondries densément emballées.
La couleur rose indique la mitochondrie unique la plus longue détectée dans l’image, ce qui est dû à l’erreur accrue dans les résultats de segmentation. Ces cas d’échec peuvent être détectés par un contrôle des longueurs des mitochondries et à l’aide d’opérateurs morphologiques. Bien que notre application soit un exemple de la façon dont nous avons effectué l’analyse de la morphologie mitochondriale, nous pensons qu’une telle analyse et des questions de recherche autour de celle-ci peuvent être formulées pour divers aspects de la mitophagie et des expériences biologiques connexes.
