Nous tenons à remercier Ryan Maneri (Productions Huîtrier, LLC) pour le tournage de notre procédure et Rodney McPhail (Département des sciences biologiques, Université de Purdue) pour l&#39;aide à l&#39;édition de la vidéo de dissection. La recherche dans le laboratoire de Suter est soutenu par des subventions du NIH (R01 NS049233) et le Centre Bindley Bioscience à l&#39;Université Purdue à DMS

Solutions <ul><li> L15-ASW milieu de culture cellulaire (1L) <ul><li> 1 sachet de poudre à L15 </li><li> Ajouter 800 ml de H 2 O ultrapure </li><li> NaCl 400 mM </li><li> MgSO 4 27 mM </li><li> MgCl 2 28 mM </li><li> L-Glutamine 4 mM </li><li> Gentamicine 50 pg / ml </li><li> HEPES 5 mM </li><li> Ajuster le pH à 7,9 </li><li> Ajouter goutte à goutte CaCl2 9,3 mM (arrêt si précipités) </li><li> Ajouter H 2 O ultrapure à 1 l </li><li> Vérifiez osmolarité (950-1000 mmol / kg) avec osmomètre (pression de vapeur, Wescor # 5520) </li><li> Filtre 0,22 um en utilisant une unité de filtration à pression positive (Filtres: SVGV010RS Millipore) </li><li> Conserver à 4 ° C jusqu&#39;à un mois </li></ul></li><li> Poly-L-lysine (70-150 kD) 200 pg / ml en solution stock stériles H 2 O ultrapure conservés à -20 o C </li><li> 0,5 M solution de MgCl2 </li></ul> Jour 1: Dissection de l&#39;aplysie ganglion abdominal Préparation de la solution enzymatique de dissociation <ol><li> Peser 90-10 mg de Dispase enzyme (Worthington, Cat: LS02111) dans un tube Eppendorf </li><li> Ajouter 900 pi de L15-ASW milieu de culture, et 100 pi de stériles H 2 O ultrapure </li><li> Mélanger et placer à température ambiante (RT) </li></ol> Dissection de ganglion abdominal <ol><li> Remplir une seringue de 50 ml avec 0,5 M de solution de MgCl2. </li><li> Prendre un animal de réservoir, la poignée doucement pour éviter de réponse animal encrage de la défense. </li><li> Placez le aplysie sur le côté sur une planche à dissection (styromousse bord), côté rostrale à la droite, côté caudale vers la gauche. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans les animaux juste derrière la tête et injecter toutes les solution de MgCl2 dans la cavité du corps. </li><li> Frottez doucement l&#39;animal pour disperser la solution de MgCl2 à travers la cavité du corps, attendre quelques minutes pour que l&#39;animal soit complètement anesthésiés. </li><li> Epingler la tête et la queue de l&#39;animal au conseil d&#39;administration de dissection avec deux aiguilles. </li><li> Utilisez une pince pour soulever la peau, couper à travers la peau et la couche musculaire avec de grands ciseaux vers la tête et la queue pour faire une grande ouverture sur le côté. </li><li> Trouvez le ganglion abdominale sous l&#39;ovaire forme de brosse. Utilisez une pince pour tenir les nerfs reliant environ 1 cm en avant du ganglion abdominal, couper les nerfs avec des ciseaux de dissection en avant de la position Davier et derrière le ganglion abdominal. </li><li> Ganglionnaires Placer dans la solution Dispase et incuber pour 15-16 h à 22 ° C en utilisant un bain d&#39;eau à température contrôlée. </li></ol> Jour 2: Placage de cellules sac aplysie Préparation poly-lysine lamelles <ol><li> Dans un banc de flux, préparer trois boîtes de Pétri de 35mm que le travail des plats pour la dissection du ganglion, les remplir avec 4 ml L15-ASW moyenne chacun. Transfert du ganglion abdominal de la solution de dispase à l&#39;un des plats ouvrables après 15,5 heures de digestion. </li><li> En utilisant des pinces de prendre nettoyés à l&#39;acide # 1.5 lamelles (22x22 mm) conservés dans l&#39;éthanol, enlever l&#39;alcool et de stériliser des lamelles en les flamboyants brièvement sur un bec Bunsen. Laissez-les refroidir avant de placer brièvement les lamelles dans les boîtes de culture. </li><li> Préparer une astuce bordé courbe en pliant un bout jaune sur le brûleur Bunsen (flamme que brièvement pour éviter la fusion du plastique!). </li><li> Préparer la quantité appropriée de 20 ug / ml de poly-lysine solution en diluant 200 pg / ml de solution concentrée avec des stériles H 2 O ultrapure. </li><li> Couvrir chaque lamelle avec 500 ul de 20 ug / ml de poly-lysine et incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Laver chaque lamelle 3-5 fois avec 500 pl stériles H 2 O ultrapure chacun. </li><li> Enlevez l&#39;eau de lamelles, remplissez chaque plat avec 4 ml de milieu de culture L15-ASW. </li></ol> La dissociation des cellules sac <ol><li> Sous un microscope de dissection, couper le ganglion abdominal de moitié des ciseaux et des pinces à dissection à l&#39;aide préalablement nettoyé avec de l&#39;éthanol à 95% (figure 1 ligne 1). </li><li> Sur une moitié du ganglion, coupé entre la grappe de cellules sac et les cellules hemiganglion (figure 1 ligne 2), et couper les extensions nerveuses restantes de l&#39;autre côté du sac de cellules (figure 1 ligne 3). Travailler sur une moitié du ganglion à un moment, laisser l&#39;autre moitié dans le plat alors que les cellules du premier groupe sont plaqués. </li><li> En utilisant deux pinces (ou une pince et des ciseaux de dissection), pôle de la cellule communiqué sac en écartant la gaine de tissu conjonctif qui entoure la grappe des piles à sac. Coupez le tissu conjonctif avec des ciseaux de dissection, si nécessaire. Attention à ne pas presser et toucher la grappe des piles à sac de trop pendant ce processus. </li><li> Quand la plupart des tissus conjonctifs est enlevé, le transfert de la bgrappe des piles ag dans un nouveau plat de travailler avec le bout plié jaune préparée plus tôt. Soyez prudent de ne pas laisser l&#39;amas de cellules valise soit emprisonné à l&#39;intérieur de la pointe jaune ou coincés à l&#39;interface air / support. </li><li> Triturer le cluster avec pointe jaune pour éliminer les cellules sac individuel. Pour ce faire, le cluster de pipetage dans et hors de la pointe. Commencez avec de faibles forces de cisaillement et d&#39;augmenter la force si nécessaire. Toujours utiliser le plus bas force nécessaire pour retirer les neurones sans tuer trop de cellules. </li><li> Recueillir 3-5 cellules saines sac et transférez-les dans un plat avec une lamelle poly-lysine. Éviter d&#39;aspirer des cellules mortes (elles sont noires / transparentes au centre) et des débris de tissu conjonctif. </li><li> Répétez l&#39;étape 6. et au lieu d&#39;environ 15-25 neurones vivants dans le centre de chaque lamelle. Si les cellules mortes ou des débris sont transférés ainsi, retirer le matériel indésirable par le ramasser ou de le souffle dans les cellules saines. Ce processus prend environ 2-3 heures pour les deux groupes. </li><li> Une fois terminé, laisser les boîtes de culture sur le banc de débit pendant au moins 2 heures à température ambiante pour permettre aux cellules de joindre (garder banc de flux de soufflerie pour éviter les vibrations hors indésirables). </li><li> Placez les plats dans un incubateur à 14 ° C pendant la nuit, ou jusqu&#39;à une utilisation ultérieure. Cônes de croissance peut se développer dans 4-10 heures. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Figure 1. Schéma d&#39;Aplysia californica ganglion abdominal. Couleur des lignes indiquent où couper pour obtenir des amas de cellules sac." /> Figure 1. Schéma d&#39;Aplysia californica ganglion abdominal. Couleur des lignes indiquent où couper pour obtenir des amas de cellules sac. Jour 3: Mise en place de chambre pour l&#39;imagerie des cellules vivantes sac aplysie Assemblée de l&#39;imagerie de chambre <ol><li> Avant d&#39;utiliser les cellules sac pour vivre des expériences d&#39;imagerie cellulaire, d&#39;inspecter les cellules sur un microscope de faible puissance. Si les cellules n&#39;ont pas développé les cônes de croissance saine, l&#39;approvisionnement en milieu frais et laisser à température ambiante pendant 1-2 heures. </li><li> Pour alimenter plaques avec le milieu L15-ASW frais, retirer la moitié (~ 2 ml) de milieu ancienne avec une ligne vide, et ajouter 2 ml de nouveaux L15-ASW milieu par boîte de Pétri. Il est important de ne pas supprimer complètement tous les moyens de l&#39;antenne tout à la fois, car cela élimine les cellules de la lamelle. </li><li> Pour l&#39;imagerie cellulaire sac, nous assembler deux lamelles et deux entretoises en plastique dans une chambre d&#39;imagerie sandwich. La lamelle supérieure dans le sandwich est coupé plus court pour permettre un échange facile des moyennes et des réactifs. Lors du montage, des lamelles avec des cellules sac attaché doit être immergé dans L15-ASW moyenne, en tout temps pour empêcher les cellules de déloger. </li><li> Pour préparer la chambre, coupé ~ 2mm du côté droit d&#39;un mm lamelles # 1 22x22 avec le diamant stylo (coupe-verre) et la règle. </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml, appliquer de la graisse sous vide poussé à deux côtés de la plus courte lamelle, et joindre entretoises en plastique de chaque côté. Appliquer de la graisse à vide au sommet de deux entretoises. </li><li> Inversez la lamelle et l&#39;entretoise, puis placer en boîte de Pétri contenant des cellules sac sur une lamelle. Aligner et appuyez doucement pour coller la lamelle de haut en bas avec la lamelle la fin inversée de deux Q-tips. </li><li> En utilisant des pinces, soulever délicatement assemblage en sandwich de la boîte de Pétri, sans le support fuite. Alignez les deux lamelles, si nécessaire, et essuyez l&#39;excédent avec un support Kimwipe. Placez le sandwich sur la partie inférieure de la porte lame de microscope et fixer le couvercle avec soin en utilisant des clips. </li><li> Nettoyez le centre de la face supérieure du sandwich avec Q-tips dans tamponné nettoyant à vitres (Sparkle est utilisé comme nettoyant pour vitres). Vite sécher le nettoyant à vitre avec une seconde, coton tige sec pour éviter les lignes série. Faites de même pour la lamelle du bas. Nettoyer sans lamelles de lignes série sont importants pour l&#39;imagerie de haute qualité. </li></ol> Sac cellules au microscope Puisque les cultures de cellules aplysie sac de neurones sont à faible densité, il est préférable si votre configuration de microscope est doté de fonctions de positionnement scène pour faciliter le passage entre les cellules. Sac cellules peut être facilement conservé à température ambiante pendant plusieurs heures sur scène lors des expériences d&#39;imagerie. Bourse à moyen périodiquement pour éviter l&#39;évaporation.

<ol>
	<li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons.">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li><li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule,+apCAM,+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling.">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li><li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones.">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li><li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering.">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li></ol>

Aplysie neurones cellulaires sac fournir un milieu sans sérum système neuronal de culture cellulaire avec très peu de cellules non-neuronales. Ces neurones forment des cônes de croissance très grand approprié pour aborder un certain nombre de questions importantes de cellules biologiques. Neurones cellulaires sac peut être facilement manipulé et imagée à la température ambiante pendant plusieurs heures. Utiliser fluorescent chatoiement de microscopie (FSM), on peut analyser quantitativement les différents paramètres de F-actine...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>#1 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48366067</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#1.5 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>2870-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm Petri dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filters for medium filtration</td>
<td>Tool</td>
<td>Millipore</td>
<td>SVGV010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Tool</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Osmometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Wescor</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic shims</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts Inc </td>
<td>SHSP-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>C79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41300-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8540</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>5958-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>6070-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine (70-150 kD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt </td>
<td>7581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease (Dispase)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LS02111</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neuronal cell cultures from aplysia for high-resolution imaging of growth cones

Cônes de croissance neuronale sont les structures très mobiles à la pointe des axones qui peut détecter des signaux de guidage dans l&#39;environnement et transduire cette information dans le mouvement directionnel vers la cellule cible appropriée. Pour bien comprendre comment les informations de guidage est transmis de la surface de la cellule à l&#39;dynamique sous-jacente des réseaux du cytosquelette, on a besoin d&#39;un système modèle approprié pour l&#39;imagerie de cellules vivantes de la dynamique des protéines à résolution temporelle et spatiale élevée. Typiques des cônes de croissance de vertébrés sont trop petits pour analyser quantitativement F-actine et la dynamique des microtubules. Les neurones de la californica lièvre de mer Aplysia sont 5-10 fois plus grandes que les neurones des vertébrés, peuvent facilement être conservés à température ambiante et sont des cellules très robuste pour la micromanipulation et de mesures biophysiques. Leurs cônes de croissance ont de très défini régions cytoplasmiques et d&#39;un système bien décrit cytosquelette. Les corps cellulaires des neurones peut être microinjectés avec une variété de sondes pour étudier la motilité du cône de croissance et d&#39;orientation. Dans le présent protocole, nous démontrons une procédure pour la dissection du ganglion abdominal, la culture cellulaire des neurones sac et mise en place d&#39;une chambre d&#39;imagerie pour l&#39;imagerie de cellules vivantes des cônes de croissance.

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Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Aplysia californica neurones de développer des cônes de croissance important dans la culture qui sont excellents pour l&#39;imagerie haute résolution de la motilité du cône de croissance et d&#39;orientation. Ici, nous présentons un protocole pour la dissection et le placage de neurones cellulaires aplysie sac ainsi que pour la mise en place d&#39;une chambre pour l&#39;imagerie de cellules vivantes.

Cultures de cellules neuronales de l&#39;aplysie pour l&#39;imagerie haute résolution des cônes de croissance

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K vues.  Purdue University. Aplysia californica neurones de développer des cônes de croissance important dans la culture qui sont excellents pour l'imagerie haute résolution de la motilité du cône de croissance et d'orientation. Ici, nous présentons un protocole pour la dissection et le placage de neurones cellulaires aplysie sac ainsi que pour la mise en place d'une chambre pour l'imagerie de cellules vivantes.

Vidéo: Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Recherche

Biologie

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Préparation des Aplysie Sensori-motrice cultures de cellules neuronales

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Génération d&#39;dispersée présomitique mésoderme cultures cellulaires pour l&#39;imagerie de la segmentation Horloge poisson zèbre dans des cellules individuelles

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Ex méthode in vivo pour l&#39;imagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...