Le travail en laboratoire impliquant la mise en culture des neurones aplysie est financé par la liste des NIH et le NIH R01 R21MH077921.

Préparation (voir la section des solutions à la fin du protocole pour la composition des solutions) <ol><li> Préparer des boîtes de culture. Manteau en verre de plat ainsi Mattek la culture à fond de verre avec de la poly-L-lysine (made in borate de sodium). Ajouter suffisamment pour couvrir complètement le verre bien et laissez reposer&gt; 1h (peut être laissé toute la nuit). Enlever soigneusement la poly-L-lysine par un rinçage à l&#39;eau de mer artificielle (ASW) 4-5 fois. Après avoir retiré le dernier rinçage, ajouter 2 ml de 50% L15 (complété par les sels et contenant de la L-glutamine à une concentration finale de 2 mM) / hémolymphe de 50%. Ce milieu de culture doit être dans le plat pendant au moins une heure avant de cellules placage, de sorte que les manteaux hémolymphe le plat. </li><li> Nettoyer les outils et les plats Sylgard avec l&#39;éthanol, les rincer abondamment à ddH 2 0 puis les placer pour&gt; 1 h sous une lumière UV dans le capot de la culture. </li><li> Préparer électrodes forte pour la microdissection des neurones. L&#39;utilisation d&#39;un extracteur de microélectrodes (par exemple, Sutter Flaming Brown P-97), tirez électrodes pipette en verre avec 1,5 mm de diamètre extérieur, de 0,86 à 1,12 mm de diamètre intérieur et 100 mm de longueur (par exemple AM ​​# 628000 catalogue système; Instruments de précision mondiale TW150-4, 1,55 / 1,12). Utiliser les paramètres qui produisent une électrode avec une pointe longue et effilée amende de haute résistance telle qu&#39;il n&#39;y ait aucun apport capillaire de liquide lorsqu&#39;il est placé dans une solution. La présence d&#39;un ménisque du liquide signifie que la pointe de l&#39;électrode d&#39;endommager des neurones lors de l&#39;isolement. Le livre de Sutter électrode fournit des lignes directrices pour la mise en place d&#39;excellents programmes de l&#39;électrode. Nous utilisons un filament boîte, et une seule étape tirez pour générer des électrodes de la culture. </li><li> Préparer la solution anesthésique (0,35 M MgCl2), milieu de culture (L15 complété par les sels et hémolymphe), et la solution de protéase (1% de la protéase de type IX, Sigma, 1 unité / mg, à une concentration finale de 10 unités / ml). </li><li> Animaux: l&#39;usage des adultes 80-100 g aplysie pour l&#39;isolation des neurones sensoriels et des neurones moteurs EPA. Utilisez juvénile 1-4 g aplysie pour l&#39;isolement de L7 neurones moteurs. Retirez délicatement les animaux provenant des réservoirs d&#39;eau de mer, et de maintenir dans l&#39;eau de mer (dans le bécher, un seau ou un sac en plastique) pour pas plus de 30 minutes avant le début de l&#39;anesthésie et la procédure de la culture. </li></ol> Procédure de la Culture A. La culture pleural neurones sensoriels de 80 à 100 g aplysie <ol><li> Anesthésier les animaux pour l&#39;enlèvement des ganglions: Injecter 0,35 M MgCl 2 dans les adultes aplysie (80-100 g) en utilisant une seringue de 60 ml avec une aiguille de calibre 18 pouces 1.5. Entrez le pied de l&#39;animal à un angle d&#39;environ 35 degrés, et ne pas entrer trop profondément. L&#39;objectif est d&#39;injecter dans le hemocoel de l&#39;animal sans pénétrer les organes internes. L&#39;animal doit devenir très distendu et détendue. </li><li> Disséquer les ganglions: Pin l&#39;animal anesthésié sur un plat de dissection, avec un axe (18 aiguilles de calibre fonctionnent bien pour les animaux g 80-100) à la tête et la queue, et le pied vers le haut. Maintenez le pied avec une pince à griffes et à traverser la peau et des tissus conjonctifs sous-jacents sur toute la longueur du pied (de la tête à la queue) avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Epingler les deux côtés vers le bas. En utilisant une pince et de ciseaux, couper l&#39;œsophage et tirer vers le côté afin d&#39;exposer les ganglions. En utilisant une pince fine et des ciseaux fins, découpez les ganglions pédieux pleural (les neurones sensoriels sont dans les ganglions de la plèvre). Laisser une bonne quantité de nerfs car cela rend plus facile à cerner les ganglions après le traitement de la protéase. </li><li> Digestion protéasique des ganglions: Placez les ganglions de la protéase en solution (10 mg / ml de 1 unité / mg dans L15) dans un incubateur réglé à 34,5 ° C (34-35 ° C est correct) pour 2 heures et 15 minutes. Utilisation de la pointe fine pince à transférer et laver les ganglions de ASW à trois reprises. Gardez les ganglions de L15. Notez que le temps d&#39;incubation peut varier de protéase. Le but est de permettre aux tissus conjonctifs pour être facilement enlevés. Si elle est trop difficile à desheath les ganglions, sans endommager les neurones, d&#39;augmenter le temps d&#39;incubation de la protéase. Si elle est extrêmement facile à desheath les ganglions, et les neurones sont «mous», réduire le temps d&#39;incubation de la protéase. </li><li> Dégainage les ganglions: Transfert de la protéase digère ganglions à un 60 mm ou un plat de 35mm contenant Sylgard et L15. Voir sous un stéréomicroscope (avec éclairage halogène externe), retirer la pédale ganglions et épingler les ganglions de la plèvre dans le plat Sylgard dans le bon sens en utilisant broches insectes et d&#39;une pince fine. Avec la pince fine et une paire de ciseaux chirurgicaux Vanna, soulevez délicatement le tissu conjonctif et le couper afin d&#39;exposer la grappe sensorielle. Soyez prudent de ne jamais toucher ni endommager le soma des neurones. Retirez tout excès de tissu conjonctif de l&#39;antenne et ajouter plus de support, en veillant à ne jamais exposer le ganglion desheathed à l&#39;air. Le cluster sensorielle est composé d&#39;environ 200 neurones regroupés de 40-50 microns de diamètre. Régler une épingle pour faire un &quot;post&quot; à une courte distance de la Ganglionique (dans le champ de vision). </li><li> Isolement des neurones: Utilisation de long, l&#39;électrode forte culture en verre, tirez la identifié les neurones un par un, en touchant le corps de la cellule juste à côté du centre (ne pas empaler) et lentement et régulièrement en tirant le corps cellulaire, de concert avec l&#39;axone, loin de la ganglionnaires. Tapoter doucement contre la goupille de déloger les neurones de l&#39;électrode. </li><li> Neurones Placage: Utiliser un Pipetman (P10) pour transférer les neurones individuels de l&#39;antenne Sylgard à une boîte de culture. Avant de transférer les neurones, un milieu de culture de pipette dans la pointe de telle sorte que le bout de plastique est recouvert d&#39;hémolymphe (cela empêche les neurones de coller à la plastique). Prenez grand soin d&#39;éviter d&#39;exposer les neurones à des bulles d&#39;air ou à des forces extrêmes (très doucement reprendre et de supprimer les neurones de la pipetteman). Distribuer les neurones uniformément dans le plat. Utiliser une électrode forte doucement droites les processus et les robinet vers le bas. </li><li> Incubation: Laissez les plats sur la platine du microscope à la température ambiante pendant au moins 3 heures. Nous faisons régulièrement les laisser toute la nuit. Assurez-vous que la platine du microscope est perturbé durant cette période. Couvrir le stade avec une feuille d&#39;aluminium pour protéger de la lumière. Doucement les transférer à un incubateur à 18 ° C. </li><li> Les cultures devraient adhérer à l&#39;antenne un délai d&#39;environ 3 heures et la croissance des neurites nouvelle devrait être visible dans les heures 6-12 environ. La croissance des neurones sensoriels isolés atteint un plateau par DIV 3 ou 4. Notez que les neurones sensoriels isolés de biche pas autapses forme ou synapses chimiques avec l&#39;autre, bien qu&#39;ils ne forment des jonctions électriques fossé. </li></ol> B. Préparation du neurone sensoriel cocultures-neurone moteur Les neurones sensoriels forment synapse avec les neurones moteurs cible dans la culture. Les neurones moteurs les plus couramment utilisés sont les neurones moteurs EPA et le neurone moteur L7, à partir du ganglion abdominal. Les neurones moteurs EPA sont isolés de l&#39;adulte (80-100 g) l&#39;aplysie, et il ya environ 20 neurones moteurs EPA par ganglion abdominal. Le L7 du neurone moteur est isolé juvénile (1-4 g) les animaux, et il n&#39;ya qu&#39;un seul L7 par ganglions abdominaux. EPA neurones moteurs sont de 40-50 microns de diamètre, sont intercalés entre les neurones sensoriels LE près de la racine du nerf siphon sur la surface ventrale des ganglions de l&#39;abdomen, et sont caractérisées par un spot pigment foncé subtile dans chaque soma. Le L7 du neurone moteur est de 100 à 150 microns de diamètre et est présente sur la surface dorsale du ganglion, sur le bord milieu du côté gauche du ganglion. Alors qu&#39;il est plus économique d&#39;utiliser l&#39;EFT neurones moteurs, la grande taille du neurone moteur L7 est avantageux pour certaines expériences. Le L11 du motoneurone, également sur la surface dorsale gauche du ganglion abdominal, caudale à L7, est un neurone moteur et non ciblées peuvent être efficacement utilisé comme un contrôle avec lequel le neurone sensoriel fasciculates mais ne forme pas des synapses chimiques. <ol><li> Anesthésier les animaux pour l&#39;enlèvement des ganglions. Pour les neurones moteurs de l&#39;EPA, faites comme décrit pour pleural neurones sensoriels. Pour L7 neurones moteurs, injecter 0,35 M MgCl 2 dans juvénile aplysie (1-4 g) en utilisant une seringue de 10 ml avec une aiguille de calibre 21. </li><li> Disséquer les ganglions abdominaux: Pin l&#39;animal anesthésié sur un plat de dissection comme décrit ci-dessus (en utilisant des aiguilles de calibre 21 pour les jeunes animaux). En utilisant une pince fine et des ciseaux fins, découpez les ganglions abdominaux. </li><li> Digestion protéasique des ganglions: Ceci est fait comme décrit pour pleural neurones sensoriels, sauf que le temps de digestion est réduite à 1 h 45 min pour des ganglions juvénile (1-4 g) les animaux. </li><li> Dégainage les ganglions: Transfert de la protéase digère ganglions à un plat de 35 ou 60 mm contenant Sylgard et L15. Voir sous un stéréomicroscope (avec éclairage halogène externe), dans les ganglions dans le plat Sylgard dans le bon sens en utilisant broches insectes et d&#39;une pince fine. Avec la pince fine et une paire de ciseaux chirurgicaux Vanna, soulevez délicatement le tissu conjonctif et le couper afin d&#39;exposer les corps cellulaires des neurones. Pour isoler les neurones moteurs EPA, broche le ganglion de sorte que la surface ventrale est tournée vers le haut, et avec une pince tirer sur la gaine de tissu conjonctif pour exposer toute la moitié du ganglion contenant de l&#39;EPA neurones moteurs (à votre droite), l&#39;desheath parties restantes du ganglion, enlever tout le tissu conjonctif du plat et ajouter plus de L15. Pour isoler le L7 ou L11 du neurone moteur, la broche le ganglion de sorte que la surface dorsale est orientée vers le haut, et avec une pince tirer sur la gaine de tissu conjonctif pour exposer la moitié du ganglion contenant à la fois L7 et L11 (à votre gauche). Soyez prudent de ne jamais toucher ni endommager le soma des neurones. Placez une épingle pour faire un &quot;post&quot; à une courte distance du ganglion (dans le champ de vision). </li><li> Isolement de neurones: les neurones Retirer avec une électrode forte que celle décrite pour les neurones sensoriels. Les neurones EPA sont differentiated à partir de neurones sensoriels LE voisins sur la base d&#39;une tache de pigment foncé dans leurs petits corps cellulaires. Le neurone L7 peut être différencié du neurone L11 abord parce que la L11 est caudale à L7, L11, car le corps cellulaire est plus de forme oblongue alors que le corps cellulaire L7 est plus rond et parce que l&#39;axone L11 tend à la branche en deux près de la cellule corps. </li><li> Neurones Placage: Utiliser un Pipetman (P10) pour transférer les neurones individuels de l&#39;antenne Sylgard à une boîte de culture tel que décrit pour les neurones sensoriels. </li><li> Jumelage avec les neurones sensoriels: Laissez les neurones moteurs adhérer à la boîte de culture pendant au moins 1 heure. Puis ajoutez les neurones sensoriels isolés avec un Pipetman, la prestation de chaque neurone sensoriel à côté d&#39;un neurone moteur plaqué. L&#39;utilisation d&#39;un verre de forte électrode attentivement redresser l&#39;axone des neurones sensoriels, et coaxiale le corps de cellules sensorielles à une position à côté du neurone moteur, à une distance égale ou légèrement inférieure à la longueur de l&#39;axone des cellules sensorielles. Utilisation de l&#39;électrode de verre, câble coaxial de l&#39;axone sensoriel pour entrer en contact avec le neurone moteur, très doucement à l&#39;aide du côté de l&#39;électrode conique d&#39;avoir enfin l&#39;axone sensoriel contact physique avec l&#39;axone du neurone moteur. Ne pas soulever la boîte de culture, mais plutôt glissent doucement le plat le long de la platine du microscope. </li><li> Laissez les plats sur la platine du microscope à la température ambiante pendant au moins 3 heures et le transfert dans un incubateur à 18 ° C comme décrit pour les neurones sensoriels. </li><li> Les cultures devraient adhérer à l&#39;antenne un délai d&#39;environ 3 heures et la croissance des neurites nouvelle devrait être visible dans les heures 6-12 environ. Les neurones sensoriels forment synapses glutamatergiques avec les neurones moteurs très rapidement - dès que la cellule sont assez adhérente pour effectuer l&#39;enregistrement d&#39;électrode forte (3-5 heures), une post-synaptiques excitateurs potentiels peuvent être enregistrées. Connectivité synaptique continue à augmenter jusqu&#39;à DIV 3, et est ensuite stable jusqu&#39;en DIV7. Les neurones doivent montrer neurites élaborée lors de un à trois premiers jours de culture. </li></ol> C. Préparation d&#39;hémolymphe Hémolymphe est utilisée comme un facteur de croissance dans la culture aplysie (analogue à l&#39;utilisation de sérum de veau fœtal en culture de cellules de mammifères). Il est recueilli à partir de grande taille (500 g-1 kg) des animaux, et le meilleur moment pour recueillir l&#39;hémolymphe (anecdotique) est au cours du printemps (mi-Mars à Juin). Swaddle l&#39;animal dans un sous-tapis jetables sorte que seule une petite partie de l&#39;animal est exposé, nettoyer cette portion de la peau avec de l&#39;éthanol, puis maintenez tandis qu&#39;une autre personne utilise une lame de rasoir stérile pour faire une incision dans la zone exposée. Pressez l&#39;animal de sorte que les jets hémolymphe dans un bécher propre, en s&#39;assurant qu&#39;il ne touche pas la peau sale de l&#39;animal. L&#39;hémolymphe remplit le hemocoel de l&#39;animal (par exemple, l&#39;animal est essentiellement un sac d&#39;hémolymphe). Remballer l&#39;animal une fois ou deux, faire une incision de nouvelles et presser difficiles à recueillir hémolymphe autant que possible (à frais virés dans un bécher de nouveaux afin que, si elle est contaminée, la première collection est encore utilisable). Hémolymphe de chaque animal doit être gardé séparément (par exemple, ne hémolymphe piscine à partir de différents animaux). Spin l&#39;hémolymphe à 2000 xg pendant 10 min pour éliminer les cellules sanguines. Aliquoter le surnageant en aliquots de 10 ml, l&#39;étiquette par un animal et stocker à -80 ° C. Notez que l&#39;hémolymphe conservés à -20 ° C forme un précipité dans le milieu. Une partie aliquote de nouvelles d&#39;hémolymphe doit être utilisé chaque fois un milieu de culture est préparé, et l&#39;aliquote doivent être décongelés juste avant la préparation du milieu. Ne pas recongeler après décongélation.

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	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

La bonne préparation des aplysie sensori-motrices des cultures a une courbe d&#39;apprentissage assez lent, car il implique le développement de la motricité fine associée à la microdissection et la manipulation des neurones individuels vue à travers un stéréomicroscope. Dans notre expérience, il faut environ 1-3 semaines de pratique pour obtenir saine isolées neurones sensoriels en culture et une semaine supplémentaire 1-3 pour apprendre à paire neurones sensoriels avec les neurones moteurs. Nous av...

Solutions nécessaires pour la culture <ol><li> 0,35 M MgCl 2, stockées à température ambiante, utilisée pour l&#39;anesthésie. </li><li> Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, PM&gt; 300000, faite en sodium borate 0,1 M pH8.2 à 0.5mg/ml solution. Vortex bien et stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um, le stocker à ° 4C. Ne pas de gel-dégel. </li><li> Poudre de milieu L-15 (Leibovitz) (Sigma: L4386) complété par les sels comme ci-dessous pour faire 1 litre <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15 en poudre </td><td> 13,8 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 g </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> 6,24 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5,49 g </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Ajouter ddH20 à 1 litre. Le pH devrait être d&#39;environ 7.4 à 7.5, ajouter 10ml de 100X Pen / Strep solution, et le filtre de stériliser à travers un filtre 0,22 m. Entreposer à 4C0 pour les plus de 1 mois. </li><li> Solution de digestion de protéase: 1% de protéase IX (1unit/mg) est faite dans L15 (complété avec des sels comme ci-dessus) ou en ASW immédiatement avant usage, stérilisée par filtration à travers un Millipore 0,22 m. 5mls devrait être suffisant pour les ganglions de deux animaux (assurez-vous que les ganglions sont complètement immergés dans une solution de protéase). Sigma a déclaré qu&#39;ils vont cesser de vendre de protéase IX. Une protéase de substitution est: dispase II (Roche Applied Science catalogue # 04942078001). </li><li> Le milieu de culture. Immédiatement avant la préparation des cultures, décongeler un aliquot de 10 ml d&#39;hémolymphe et le mélanger avec 10 ml de L15 (complété avec des sels ci-dessus) pour faire un milieu de culture 20mls. Ajouter 200 pi de 200mm L-Glutamine, bien mélanger et à utiliser pour préparer des cultures. Ce milieu doit être préparé à chaque fois les cultures sont faites. </li><li> Eau de mer artificielle peut être faite de Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) ou comme suit: 450 mM NaCl, 10 mM de KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mM MgSO 4, 10 mM de CaCl 2 (2H 2 O), 10 mM HEPES, avec un pH ajusté à 7,4. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

Le système nerveux de l&#39;aplysie californica mollusque marin est relativement simple, composé d&#39;environ 20 000 neurones. Les neurones sont de grande taille (jusqu&#39;à 1 mm de diamètre) et identifiable, avec des tailles différentes, des formes, positions et les pigmentations et les corps cellulaires sont exposées à l&#39;extérieur en cinq ganglions jumelé distribués dans tout le corps de l&#39;animal. Ces propriétés ont permis aux enquêteurs de délimiter les circuits qui sous-tendent les comportements spécifiques chez l&#39;animal 1. La connexion monosynaptique entre les neurones sensoriels et moteurs est une composante centrale du réflexe de retrait des branchies chez l&#39;animal, un simple réflexe de défense dans lequel l&#39;animal se retire de ses branchies, en réponse à une stimulation tactile du siphon. Ce réflexe subit des formes d&#39;apprentissage non-associatif et associatif, y compris la sensibilisation, l&#39;accoutumance et le conditionnement classique. Un avantage particulier à l&#39;étude de la plasticité synaptique, la synapse sensori-moteur peut être reconstituée dans la culture, où bien caractérisés stimuli suscitent des formes de plasticité qui ont des corrélats directe dans le comportement de l&#39;animal 2,3. Plus précisément, l&#39;application de la sérotonine produit un renforcement synaptique qui, selon le protocole d&#39;application, dure quelques minutes (à court terme de facilitation), heures (à moyen terme de facilitation) ou jours (facilitation à long terme). En revanche, l&#39;application de la FMRFamide émetteur peptide produit un affaiblissement synaptique ou la dépression qui, selon le protocole d&#39;application, peut durer de quelques minutes à plusieurs jours (dépression à long terme). La grande taille des neurones permet d&#39;enregistrer l&#39;électrode répétées forte de la force synaptique au cours des périodes de jours ensemble avec microinjection de vecteurs d&#39;expression, et d&#39;autres composés siRNA pour cibler des cascades de signalisation et les molécules et ainsi d&#39;identifier les étapes moléculaires et cellulaires biologiques qui sous-tendent les changements de l&#39;efficacité synaptique. Un avantage supplémentaire du système de culture de l&#39;aplysie vient du fait que les neurones de démontrer la spécificité des synapses dans la culture 4,5. Ainsi, les neurones sensoriels ne forment des synapses avec eux-mêmes (autapses) ou avec d&#39;autres neurones sensoriels, et ils ne forment des synapses avec des non-cibles identifiés dans les neurones moteurs de la culture. Les varicosités, les sites de contact synaptiques entre les neurones sensoriels et moteurs, sont assez grandes (2-7 microns de diamètre) pour permettre la formation des synapses (ainsi que des changements dans la morphologie synaptique) avec les neurones moteurs cible à être étudiés au niveau du microscope optique. Dans cette vidéo, nous démontrons chaque étape de la préparation des cultures de neurones sensori-moteurs, y compris les adultes et les anesthésier aplysie juvénile, disséquant leurs ganglions, la digestion de la protéase du ganglion, l&#39;enlèvement du tissu conjonctif par microdissection, l&#39;identification des deux neurones sensoriels et moteurs et l&#39;enlèvement de chaque type cellulaire par microdissection, le placage du neurone moteur, plus du neurone sensoriel et la manipulation des neurites sensoriels pour former le contact avec la culture des neurones moteurs.

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Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Des cultures primaires de<em&gt; Aplysie</em&gt; Sensori-motrices des neurones fournir une préparation modèle pour étudier la formation des synapses et la plasticité synaptique<em&gt; In vitro</em&gt;. Cette vidéo montre l&#39;identification et la microdissection des neurones sensoriels et moteurs de<em&gt; Aplysie</emGanglions&gt; ainsi que les méthodes pour établir et maintenir sensori-motrices des neurones en culture.

Préparation des Aplysie Sensori-motrice cultures de cellules neuronales

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

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Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

15.9K vues.  University of California, Los Angeles. Des cultures primaires de Aplysie Sensori-motrices des neurones fournir une préparation modèle pour étudier la formation des synapses et la plasticité synaptique In vitro. Cette vidéo montre l'identification et la microdissection des neurones sensoriels et moteurs de Aplysie ainsi que les méthodes pour établir et maintenir sensori-motrices des neurones en culture.

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ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES Cell dérivé des cultures cellulaires neuroépithéliales

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

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Biologie

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Cultures de cellules neuronales de l&#39;aplysie pour l&#39;imagerie haute résolution des cônes de croissance

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Préparation et entretien des neurones ganglions de la racine dorsale dans les cultures à compartiments

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Préparation des cultures de cerveau de rat d&#39;agrégation pour Neuron et études sur le développement Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...