Nous tenons à remercier les membres de l&#39;équipe de Wan Lam Lab tableau BAC particulier Miwa Suzuki et Bryan Chi pour la préparation de cet article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé, Génome Canada / Génome Colombie-Britannique, et le NIH / NIDCR octroi RO1 DE15965-01.

SONDE D&#39;ETIQUETAGE Remarque: limiter l&#39;exposition des Colorants Cye à la lumière, à tout moment (cela peut être réalisé en travaillant dans une zone obscurcie ou en protégeant les tubes avec une couverture comme le papier d&#39;aluminium) <ol><li> Combiner: (Configuration 1 tube de réaction pour référence et 1 tube de réaction pour l&#39;échantillon) <ul><li> L&#39;ADN (25-400 ng) </li><li> 5 pi de tampon 5X amorces aléatoires (concentration finale: 5X Promega Klenow tampon et 7 pg / uL octamères aléatoire) </li><li> Diluer à 17,0 volume total d&#39;eau distillée uL H 2 O </li></ul></li><li> Faire bouillir pendant 10 minutes à 100 ° C. Transfert immédiatement à la glace pendant 1 minute. </li><li> Ajouter 4 pi de mélange dNTP 10X (2 mM de dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm). </li><li> Ajouter CyeDyes: <ul><li> Ajouter 2 uL (2 nmoles) de Cy-3 dCTP marqués à l&#39;ADN échantillon </li><li> Ajouter 2 uL (2 nmoles) de Cy-5 étiqueté dCTP à l&#39;ADN de référence (par exemple, l&#39;ADN génomique humain Novagen) </li></ul></li><li> Ajouter 2,5 pi de Klenow (9 U / uL, Promega) et mélanger. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant la nuit * (~ 18 heures). * Le temps d&#39;hybridation pendant la nuit peut être ajustée entre 14 à 24 heures sans affecter négativement le processus d&#39;étiquetage pour s&#39;adapter à un horaire de laboratoire. </li></ol> Purification de l&#39;échantillon (Sonde combinée de nettoyage et de préparation à l&#39;hybridation) <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un Microcon YM-30 colonne: <ul><li> Ajouter 100 Cot-1 uL d&#39;ADN (1μg/μL) à la colonne. Ne pas toucher la membrane avec la pointe de pipette. </li><li> Piscine les réactions (référence et échantillon) et ajouter à la colonne. </li><li> Colonne de la Place dans le tube fourni et centrifuger à 13000 g pendant 10 minutes. </li><li> Ajouter 200 ul distillée H 2 0 à la membrane et répéter spin pour se laver. </li><li> Jeter le tube et ajouter 45 uL solution d&#39;hybridation: (Roche DIG Easy) </li></ul> Optionnel: Ajouter 5uL ADN cisaillé de sperme de hareng (unité 10μg/μL, Promega) <ul><li> Inverser Microcon, placer dans un nouveau tube étiqueté, et tournent à 3000 g pendant 3 minutes. </li></ul></li></ol> CALCUL DU INCORPORATIONS <ol><li> Retirez 1,5 uL et l&#39;incorporation fluorophore mesurer à l&#39;aide Spectrophotomètre NanoDrop. Utilisation de votre tampon d&#39;hybridation comme une vierge (DIG Easy) suivez les instructions à l&#39;écran. (Vous pouvez récupérer l&#39;échantillon du piédestal, si nécessaire, après la mesure.) (Remarque:. Incorporations inférieur à 3,0 pmol / uL dans deux canaux ont montré des résultats variables) </li><li> Dénaturer à 85 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Placez la sonde à 45 ° C pendant 30 minutes à 1 heure (Cot-1 permet l&#39;ADN recuit.) </li></ol> HYBRIDATION ARRAY <ol><li> Placer 44 uL solution de sonde sur la lamelle (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Si possible, placer la lamelle sur une lame chaude ou de bloquer la chaleur pré-chauffé à 45 ° C pour maintenir la température. </li><li> Aligner glisser sur la lamelle et solution de sonde, la baisse d&#39;un bord de la diapositive permettant le contact avec la solution d&#39;hybridation. Continuer d&#39;abaisser jusqu&#39;à ce que la lamelle est attaché à la lame avec la tension de surface. Inverser la diapositive. </li><li> Placer la lame dans la cassette d&#39;hybridation (Telechem), pré-chauffé à 45 ° C, et ajouter 10 uL d&#39;eau dans la rainure inférieure (pour contrôler l&#39;humidité lors de l&#39;hybridation). </li><li> Cassette Seal et incuber pendant 36 - 40 heures à 45 ° C. </li></ol> LAVAGE ARRAY Note: Toutes les solutions de lavage sont à pH 7,0 Retrait de la glissière de la cassette hybridation est critique. DIG Facile cristallise rapidement à température ambiante. La lame doit être immédiatement immergé et la lamelle enlevée dans la solution de lavage. <ol><li> Ajouter environ 60 ml d&#39;0.1XSSC, SDS 0,1% (pH 7,0, 45 ° C) la solution de lavage à une jarre de Coplin avant l&#39;ouverture de la chambre d&#39;hybridation. </li><li> Ouvrez la chambre, ajoutez diapositive à la solution de lavage et enlever la lamelle (il faut glisser). </li><li> Laver la lame 3 fois dans 0.1XSSC + 0,1% SDS à 45 ° C pendant 1 minute chacun avec agitation. </li><li> Rincer la lame 3 fois dans 0.1XSSC frais *. Il devrait y avoir aucune bulle résiduelle de la SDD se laver visibles. * Les diapositives peuvent rester dans la solution de lavage final jusqu&#39;au moment de centrifugeuses et de numérisation (~ 15 minutes). </li><li> Centrifuger la lame dans un des tubes de 50 ml Falcon à 700 g pendant 3 minutes. </li><li> Immédiatement numériser les diapositives (intensités du signal diminue avec le temps.) </li></ol>

<ol>
	<li>Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+array+comparative+genomic+hybridization+technologies+and+their+applications+in+human+genetics.">Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics.</a> European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).</li><li>Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiling+resolution+DNA+microarray+with+complete+coverage+of+the+human+genome.">A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome.</a> Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).</li><li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+high+throughput+validation+of+amplified+fragment+pools+of+BAC+DNA+for+constructing+high+resolution+CGH+arrays.">Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays.</a> BMC Genomics. 5, 6 (2004).</li><li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetically+balanced+translocations+are+associated+with+focal+copy+number+alterations.">Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations.</a> Human Genetics. 120, 795-805 (2007).</li><li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeGH+--+a+software+tool+for+visualization+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization+data.">SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data.</a> BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).</li><li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MD-SeeGH:+a+platform+for+integrative+analysis+of+multi-dimensional+genomic+data.">MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data.</a> BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).</li><li>Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+resolution+of+array+CGH.">Resolving the resolution of array CGH.</a> Genomics. 89, 647-653 (2007).</li><li>Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+array+CGH+increases+heterogeneity+tolerance+in+the+analysis+of+clinical+samples.">High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples.</a> Genomics. 85, 790-793 (2005).</li></ol>

La mauvaise qualité de l&#39;ADN ne fournira pas un profil d&#39;hybridation bien. Il est essentiel de s&#39;assurer que l&#39;échantillon d&#39;ADN de référence et sont exempts de contaminants tels que le phénol, l&#39;ARN, le sel, etc qui peuvent interférer avec l&#39;étape de marquage Premier aléatoire avant de commencer une expérience d&#39;hybridation. Par exemple, la remise en suspension de l&#39;ADN dans Tris - EDTA (TE) au lieu de l&#39;eau n&#39;est pas recommandée car la concentration en sel élevée peut inhiber la réa...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5X Klenow Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random Octamers </td>
<td>Reagent</td>
<td>Alpha DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X dNTP mix</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy-3 labeled dCTP</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 labeled dCTP</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Genomic DNA Reference</td>
<td>Reagent</td>
<td>Novagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Example of a possible reference</td>
</tr>
<tr>
<td>Klenow</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YM-30 Column</td>
<td>Reagent</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cot-1 DNA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG Easy</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sheared Herring Sperm DNA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslip</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>22mm x 60mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Cassette</td>
<td>Tool</td>
<td>Telechem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization

Hybridation génomique comparative (CGH array) est une méthode pour détecter les gains et pertes de segments d&#39;ADN ou le dosage des gènes dans le génome 1. Les avancées récentes dans cette technologie ont permis de comparaison haute résolution des génomes entiers pour l&#39;identification d&#39;altérations génétiques dans le cancer et autres maladies génétiques 2. Le Sous-Megabase Résolution Carrelage-set tableau (ou SMRT) tableau est composé d&#39;un ensemble d&#39;environ trente mille bactéries qui se chevauchent chromosomes artificiels (BAC) des clones qui couvrent le génome humain en ~ 100 paires kilobases (kb) des segments 2. Ces cibles d&#39;alcoolémie sont individuellement synthétisés et repéré en double sur une lame de verre simple 2-4. CGH array est basé sur le principe de l&#39;hybridation compétitive. Des échantillons et l&#39;ADN de référence sont étiquetés avec différentiel Cyanine-3 et colorants de cyanine-5 fluorescentes, et co-hybride à la matrice. Après une période d&#39;incubation de l&#39;échantillon non liés sont lavés de la diapositive et le tableau est imagé. Un logiciel librement disponible personnalisé appelé SeeGH (www.flintbox.ca) est utilisé pour traiter l&#39;important volume de données recueillies - une expérience unique génère 53 892 points de données. SeeGH visualise le ratio d&#39;intensité de signal entre le log2 2 échantillons à chaque cible d&#39;alcoolémie qui est aligné verticalement avec la position chromosomique 5,6. Le tableau SMRT peut détecter des altérations aussi petite que 50 kb 7. Le tableau SMRT peut détecter une variété d&#39;événements réarrangement d&#39;ADN y compris les gains d&#39;ADN, des pertes, des amplifications et délétions homozygotes. Un avantage unique de la matrice de SMRT est que l&#39;on peut utiliser l&#39;ADN isolé à partir d&#39;échantillons de paraffine fixés au formol embarqués. Lorsqu&#39;il est combiné avec les exigences d&#39;entrée faible de l&#39;ADN non amplifié (25-100 ng) ce qui permet le profilage des échantillons précieux tels que ceux produits par microdissection 7,8. Ceci est attribué à la grande taille de chacune des cibles hybridation BAC, qui permet la liaison de suffisamment d&#39;échantillons étiquetés pour produire des signaux pour la détection. Un autre avantage de cette plateforme est la tolérance de l&#39;hétérogénéité des tissus, en diminuant le besoin de microdissection tissulaire fastidieuse 8. Ce protocole est un tutoriel vidéo étape par étape, de marquage de l&#39;ADN d&#39;entrée grâce à l&#39;acquisition du signal pour le tableau du génome de carrelage SMRT toute voie.

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Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Cette vidéo est une démonstration technique du protocole d&#39;hybridation pour l&#39;ensemble du génome de carrelage CGH array chemin, qui scanne l&#39;ensemble du génome humain en utilisant seulement 25 à 100 ng d&#39;ADN qui peuvent être isolées à partir de diverses sources, y compris les archives du matériel fixé au formol.

Démonstration technique de l&#39;hybridation tableau Whole Genome génomique comparative

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

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12.6K vues.  BC Cancer Research Centre. *The slides can remain in the 