גדילה והתמיינות של מבוגרים בהיפוקמפוס סנאי הארקטי קרקע תאים גזע עצביים

Summary

בתאי גזע עצביים הוכנו מן ההיפוקמפוס של מבוגרים שאינם חורף סנאים בן שנה הארקטי הקרקע (AGS). תאים אלה גזע עצביים ניתן להרחיב באמצעות מעברים רבים, להיבדל ומתוך רצון להישמר כמו נוירון 50:50 כמעט לתרבות גליה.

Abstract

סנאים הארקטי הקרקע (Urocitellus parryii, AGS) הם ייחודיים ביכולתם שינה עם טמפרטורת הליבה גוף ליד או מתחת לאפס ^1. בעלי חיים אלה גם להתנגד לפגיעה איסכמית למוח in vivo ^2,3 ו בחמצן גלוקוז קיפוח במבחנה ^4,5. אלו תכונות ייחודיות סיפק את הדחיפה כדי לבודד נוירונים AGS לבחון מאפיינים עצביים הטבועה זה יכול להסביר את היכולת של נוירונים AGS להתנגד פציעה ומוות התא הנגרם על ידי איסכמיה וטמפרטורות נמוכות מאוד. חלבונים או זיהוי מטרות הגן המאפשרים את המאפיינים הייחודיים של התאים האלה יכול לסייע לגילוי טיפולים יעילים במשך מספר אינדיקציות איסכמית לחקר סובלנות קר. ההיפוקמפוס למבוגרים AGS מכיל בתאי גזע עצביים אשר ממשיכים להתרבות, ומאפשר הרחבה קלה של אלה בתאי גזע בתרבות. אנו מתארים כאן השיטות שבהן חוקרים יכולים להשתמש אלה בתאי גזע נוירונים הבדיל עבור כל מספר של מטרות. על ידי ביצוע השלבים הבאים מקרוב התאים העצביים AGS גזע ניתן להרחיב באמצעות שני קטעים או יותר, ואז הבדיל לתרבות גבוהה TUJ1 חיובי נוירונים (~ 50%) ללא שימוש בכימיקלים רעילים כדי למזער את מספר התאים המתחלקים. איסכמיה גורמת neurogenesis ⁶ ו neurogenesis אשר ממשיך דרך ה-MEK / ERK מסלולים PI3K/Akt הישרדות איתות תורם התנגדות איסכמיה in vivo ⁷ ו במבחנה ⁸ (קלהר, אנדרסון, דרו et al., בהכנה). אפיון נוסף של תאים עצביים אלה ייחודיים יכולים לקדם בחזיתות רבות, תוך שימוש בחלק או בכל השיטות הללו.

Protocol

1. AGS עצבית לתאי גזע ומדיה הכנה

1. סנאי הקרקע הארקטי למבוגרים בהיפוקמפוס (AGS) בתאי גזע עצביים מבודד באופן שתואר קודם ⁹ כעת ניתן להשיג מסחרית כמו בקבוקוני cryopreserved. תאים נשלחים ללון חבילות מבודד המכיל קרח יבש על מנת להבטיח כי התאים להישאר במצב cryopreserved. כדי לשמור על שלמות, לפרוק את התאים מיד לאחר קבלת ולאחסן בו נמוך מ -150 ° C, או בשלב אדים של חנקן נוזלי דיואר.
2. הכן בינוני בסל agsNSC + 5% FBS ידי הוספת 5 מ"ל FBS (LS-1012) לבינוני 95 מ"ל agsNSC בסל
3. הכן בינוני הרחבת agsNSC ידי הוספת 500 B-27 μL מוסף (Invitrogen) לבינוני 50 מ"ל agsNSC בסל. מחלקים את יתרת B27 לתוך 1mL aliquots ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
4. חם 25 מ"ל של מדיום בסל agsNSC + 5% FBS ו 20 מ"ל של מדיום הרחבת agsNSC בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
5. מעיל צלוחיות המשמש להרחבת עם פולי-L-ornithine
   1. ההפשרה פתרון poly-L-ornithine (10 מיקרוגרם / מ"ל) עובד. אחסן את הפתרון בין 2-8 מעלות עד חודש מופשר פעם.
   2. הוסף 8 מ"ל פולי-L-ornithine פתרון הפועלים בקבוק one-T-75 ו פרקו שווה להפיץ את הפתרון על פני תרבות שלמה של הבקבוק. (התאמת כמות פתרון עובד כלי תרבות אחרים שעשויים לשמש השתמש 0.5 -.. 1.0 מ"ל פולי-L-ornithine פתרון לכל עובד 10 פני ² ס"מ תרבות)
   3. דגירה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 24 שעות. (שימוש באינקובטור ללא CO ₂ הוא הוסיף המועדפת הדגירה של פולי-L-ornithine כלי תרבות מצופה). צלוחיות מצופה ניתן לאחסן עד שבועיים בחממה.
   4. לפני השימוש, לשאוב פולי-L-ornithine פתרון עובד מהבקבוק פעמיים ולשטוף עם מים סטריליים תרבות רקמות כיתה. לשאוב נוזל הבקבוק עד יבש כמעט לפני השימוש.
6. הסר בקבוקון של דיואר ובדוק את הכובע בקבוקון אטום היטב. החזק את החלק העליון של הבקבוקון להשאיר את החצי התחתון של הבקבוקון בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ 60-90 שניות או עד הבקבוקון הוא מופשר כמעט לחלוטין, כמות קטנה של קרח עדיין צריך להיות גלוי. כדי למנוע אפשרות של זיהום, לשמור על כובע בקבוקון מחוץ למים. אל על הפשרה, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לתאים.
7. תרסיס החיצוני של הבקבוקון עם אתנול 70% או isopropanol, אז במקום את הבקבוקון בארון בטיחות ביולוגית. הסר את המכסה בזהירות, כדי למנוע זיהום או להתיז.
8. בעדינות מחדש להשעות את התאים הבקבוקון על ידי הוספת 1 מ"ל של התקשורת בסל agsNSC + 5% FBS בעזרת פיפטה סטרילית. העברה מחדש מושעה התאים 25 מ"ל של מדיום חם בסל agsNSC + 5% ב FBS צינור 50 צנטריפוגות מ"ל.
9. שוטפים את cryo-בקבוקון פעם עם ההשעיה תא מדולל. צנטריפוגה התאים ב XG 150 במשך 6 דקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לחשב את מהירות עבור כל סוג צנטריפוגות בודדות.
10. בעוד התאים הם מסתובבים למטה, להוסיף 10 מ"ל של מדיום הרחבת agsNSC ל-T-75 פולי-L-ornithine יבשים מצופים בקבוק ולהוסיף 40 μL של FGF-RH בסיסיים (40ng/mL). בעקבות צנטריפוגה, לשאוב את הנוזל supernatant נזהרת שלא לשאוב את הכדור. Re-להשעות את התאים של 10 מ"ל בינוני הרחבת agsNSC. העברה מחדש מושעה תאים בינוני הרחבת agsNSC לתוך התקשורת בקבוק T-75.
11. בעדינות רוק כלי תרבות צד אל צד כדי לפזר באופן שווה תאים בתוך הכלי.
12. המקום seeded תרבות כלי שיט 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור. תאים צריכים לצרף הבקבוק ולהתחיל לגבש תהליכים בתוך שעתיים של זריעה. אם התאים נשארים צפים מכורבל בתוך המדיום, אז צנטריפוגות תאים 5% FBS ולהפעיל צעדים 1.8-1.10 בינוני עם בקבוק טריים.

2. הרחבת AgsNSC

1. יומיים (~ 48 שעות) לאחר ההפשרה לבין זריעת התאים, החלפת בינוני מלא אמור להתבצע באמצעות 20 מ"ל של מדיום הרחבת agsNSC בתוספת ספייק 40 μL של FGF-RH בסיסיים.
2. ספייק צלוחיות עם 40 μL של FGF-RH בסיסי על חיסון למחרת. התאים יהיה מוכן trypsinize כאשר הם הגיעו מפגש 75-80% ביום השלישי או הרביעי לאחר חיסון. Culturing שתאי הגזע מובחן יותר מ 4 ימים לאחר חיסון אינו מומלץ משום הדגירה כבר יאפשר תאים להתחיל לבדל את הנוירונים ונוירונים עלול להיפגע trypsinization במהלך שלב 3. RH FGF-בסיסי יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע ועדיין לשמור על פעילות. FGF-RH בסיסי יכול גם לעבור להקפיא one להפשיר נוסף / ב -20 ° C אם דרוש זמן נוסף.

3. Trypsinization של תאים

1. agsNSC צריך להיות passaged 3 עד 4 ימים לאחר חיסון. הכינו בקבוק poly-L-ornithine מצופה בין 24 שעות ו שבוע לפני passaging אם agsNSC יורחב שוב.
2. לשאובבינוני מספינת תרבות. הוסף 2.5 מ"ל של 0.05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) לכלי השיט עבור כל 75 ס"מ ² של פני השטח. מערבולת בעדינות על מנת להבטיח שכל התאים מכוסים טריפסין / EDTA. תאים בדרך כלל מתחילים להתנתק פני השטח בתוך 60 שניות, תלוי מפגש של התאים. אל על trypsinize, מכיוון שהדבר יגרום נזק לתאים. בעדינות הקשה כלי תרבות מכמה צדדים יעודדו ניתוק.
3. ברגע שתאי להיות מנותקת, להוסיף 10 מ"ל של מדיום בסל agsNSC + 5% FBS אל הבקבוק. מערבולת בעדינות על מנת להבטיח את כל הפתרון טריפסין מנוטרלת. באמצעות טכניקות מעבדה aseptic, פיפטה את התאים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי המכיל 10 מ"ל של agsNSC בסל 5% FBS בינוני. חזור על ידי שטיפה את הבקבוק שוב עם 10 מ"ל נוספים של בינונית בסל agsNSC + 5% FBS ולשלב עם לשטוף הראשונה.
4. תאים צנטריפוגה ב XG 150 במשך 6 דקות כפי שתואר לעיל. לאחר צנטריפוגה, התאים צריכים צורה כדורית משוחרר ונקי. לשאוב טריפסין לנטרל ובינוניים מהצינור צנטריפוגות מחדש להשעות את התא גלולה ב 10 מ"ל (T-75 לכל בקבוק) של בינונית מראש חימם בסל agsNSC + 5% FBS ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2X עם טפטפת 10 מ"ל. ביצוע ספירת תא כמתואר להלן.

4. חישוב תקן ציפוי של תאים

1. באמצעות טכניקה aseptic, מערבולת ההשעיה תא והעברת 15 μL של ההשעיה התא צינור microcentrifuge. הוסף 15 μL של 0.4% Trypan כחול. מערבבים בעדינות לטעון 10 μL ההשעיה תא לכל אחד לשכות hemacytometer נקי כגון קו מוארת ספירת הקאמרית (קטלוג # 1490: האוסר מדעי, http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm ).
2. הרוזן מינימום של 4 הרביעים על hemacytometer. התאים הכחולים כי הם חיוביים Trypan כחול מתים ואסור לסמוך. עבור ספירת תא מדויק, המספר האופטימלי של תאים לכל ברבע צריך להיות 25-75 תאים.
3. לאחר ספירת תאים, לחשב את הממוצע של 4 הרביעים. הכפלת הממוצע לספור תאים על ידי ועל ידי 10000 פקטור התימהול (2 כרכים אם באמצעות מומלץ) כדי לקבוע את מספר התאים לכל מ"ל. שים לב שאם הכדאיות האחוז הכולל הוא פחות מ 92% ייתכנו מספר סיבות. אחת הסיבות הכדאיות נמוכה עשוי להיות מעל trypsinization, לפני טריפסין נטרול עם FBS. סיבה נוספת עשויה להיות כי ריכוז בסרום (FBS) כדי טריפסין הוא נמוך מדי, התאים ממשיכים להיות trypsinized. שלישית, התאים אולי ומחוברות יותר מדי, גורם לתאי גזע להבדיל עקב מגע תאים תאים, מובילה לפגיעה במהלך trypsinization. אם שיטה זו ובעקבותיו תשואה של 3 או יותר הכפלות שניתן לצפות, מתן אוכלוסיה של> 4,000,000 תאים ממספר ראשונית של ~ 500000.

5. הרכבה של Flask הרחבה נוספת

1. כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים נדרש לחסן one כלי שיט, להכפיל את צפיפות זריעה הרצוי (6600 תאים לכל ² ס"מ או 500.000 תאים לכל בקבוק T-75) על ידי שטח הפנים (בס"מ ²⁾ של כלי השיט לקבל חיסונים. אם inoculating יותר כלי להכפיל את מספר התאים לכל כלי במספר הכולל של כלי. כדי לקבוע את נפח (מ"ל) של השעיה התא צריך לחסן כל כלי שיט, יש לחלק את מספר התאים הדרושים כדי לחסן one כלי במספר התאים קיימא / mL ההשעיה התא. אם inoculating יותר כלי לחשב את הנפח הכולל של השעיה תא הדרוש על ידי הכפלת נפח הדרושים כלי אחד על ידי המספר הכולל של כלי לקבל חיסונים.
2. צנטריפוגה נפח הרצויה של תאים בינוני בסל agsNSC + 5% FBS, משאיר גלולה רופף. בדרך כלל 500,000 תאים מובאים בהיקף כולל של 25 מ"ל ב בינוני בסל agsNSC 5% FBS כפי שתואר לעיל. לשאוב נוזל מחדש להשעות את גלולה רופף 10 מ"ל של מדיום הרחבת agsNSC צנטריפוגה זה צעד נוסף נדרש להסיר FBS לפני חיסון. הוסף 10 מ"ל של מדיום מראש חימם הרחבת agsNSC אל הבקבוק T-75. מוסיפים 10 מ"ל של השעיה תא resuspended אל הבקבוק T-75 ואז להוסיף 40 μL של FGF-RH הבסיסית הבקבוק. חישבו כי trypsinization ו חיסון צריך לקחת לא יותר מ 1.5 שעות כאשר מחליטים את המספר המרבי של צלוחיות לעבוד עם בכל זמן נתון. אחת צריך גם התקשורת מספיק שינויים התקשורת להשלים אם באמצעות צלוחיות רבות.
3. רוק בעדינות את הבקבוק מצד לצד כדי לפזר באופן שווה את התאים למקום כלי התרבות לתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור, כפי שתואר קודם לכן.

6. דילול של תאים עבור הרכבה של לוחות ובכן לבידול

1. פורמט מרובה גם עשוי לשמש, אבל חיסון לתוך BD Biocoat _{פולי-L-ליזין} 96 צלחות מצופים היטב הוא described כאן. קבע את עוצמת הקול של השעיה תא הדרוש עבור הניסוי שלך על ידי הכפלת מספר בארות להיות מחוסן ידי 0.2 מ"ל לכל צלחת היטב רב גם 96 ולהוסיף כ -10% כדי לכסות כל הפסד בהיקף במהלך חיסון. חשב את דילול צפיפות תא של 75,000 תאים / מ"ל. לקבוע את כמות FBS שיתווספו בינוני הבידול להשיג ריכוז סופי של FBS 2% (טבלה 1). מערבבים את FBS ובינוניים דיפרנציאציה. לערבב בזהירות את התאים עם נפח המחושב של התמיינות בינונית עם FBS. (הערה: במהלך צנטריפוגה התאים נמצאים בסל agsNSC בינוני + 5% FBS בעוד FBS ומגן על התאים במהלך צנטריפוגה ומקל הידבקות התא FBS מעכב differention דילול FBS 2% יאפשר הדבקה של תאים על פני השטח רב הבאר... FBS 2% הוא מדולל ואז להמשיך לקדם את הבידול. אינסולין transferrin, סלניום (e-ITS) נכלל גם במדיום בידול כדי לקדם את הבידול.
2. בארון biosafety, לוותר על 200 UL ההשעיה תא בדילול מתוך מאגר combitip סטרילי היטב בכל צלחת פולי-L-ליזין 96-מצופה היטב בעזרת פיפטה רב ערוצי וטיפים פתח גדול. דגירה הצלחות 1.5-2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. אחרי התאים יש המצורפת, לאחר כ -90 עד 120 דקות, להסיר בזהירות 50% (100 μL עבור 96-היטב צלחות) של המדיום מכל טיפים היטב בעזרת פיפטה פתח גדול. בזהירות להחליף את הסיר עם נפח בינוני חם בידול agsNSC, שוב באמצעות פיפטה טיפים פתח גדול. (שימוש טיפים פתח סטנדרטי עלול לפגוע בתאים).
3. יומיים אחרי חיסון (~ 48 שעות), לבצע שינוי בינוני 50% באמצעות בידול agsNSC בינוני גדול פיפטה טיפים פתח.

7. תחזוקה של נוירונים

1. הכן בינוני תחזוקה העצבית באמצעות, NeuraLife גלוטמין ו - B27 לכל ההוראות. בינוני תחזוקה העצבית צריכים להיות מוכנים לשבוע.
2. יומיים לאחר השינוי שעבר התמיינות agsNSC בינוני, בדרך כלל יום 4 חיסון לפרסם, לבצע החלפת בינוני של 50% בשימוש בינוני תחזוקה עצביים.
3. המשך לבצע החלפות בינוני של 50% בשימוש בינוני תחזוקה העצבית כל 2 עד 3 ימים. תהליכים עצביים אמור להופיע תוך כמה ימים של שינוי לבינונית תחזוקה עצביים. התאים יש להשתמש תוך 3 שבועות של המועברים בינוני תחזוקה עצביים. נוירונים ניתן לזהות באמצעות מספר סמנים עצביים זמינים מסחרית. האסטרוציטים גם תמיד ציין.
4. אוכלוסיות תרבות בדרך כלל להביע יחס יותר מ 40% של הנוירונים למספר התא הכולל. השימוש בתקשורת נוירון תחזוקה אחר מאשר NeuraLife עשויה לספק תאים נחותים כי לא נראה בוגר מורפולוגית ולא יכול לשרוד כל עוד בתרבות.

8. נציג תוצאות:

סנאי הקרקע הארקטי בוגר לתאי גזע עצביים ימשיך להכפיל כל 24 שעות למשך 3 עד 5 ימים לפחות שני קטעים, כאשר זורעים בכל בקבוקון 500,000-600,000 cells/75mm. תאים אלה יהיה בקלות להבחין עם הסרת basicFGF ו B27 ואת הנוכחות של FBS 1-2% ו 1% אינסולין / transferrin / סלניום, ו יהפכו TUJ1 (Covance) נוירונים חיובי בתוך 14-21 ימים (ראה איור 2). היחס בין נוירונים לתאים הכולל ינוע בין 40-60%, תלוי בגיל של התרבות (איור 3). נוירונים עשוי להיות מנוצל עבור ניסויים של 12 ימים שלאחר זריעת דרך לפחות 21 ימים לאחר הזריעה.

באיור 1. Photomicrograph של AGS תאים בהיפוקמפוס מבוגר גזע עצביים.
שלב photomicrograph של AGS בהיפוקמפוס מבוגר בתאי גזע עצביים לאחר 3 ימים של צמיחה בתקשורת הבסיס agsNSC פולי ב-L-ornithine צלוחיות מצופה. ההכפלה מתרחשת בערך כל 24 שעות. התמונה בהגדלה 100x.

איור 2. פלורסנט מיקרוסקופ של הבדיל AGS תאים בהיפוקמפוס מבוגר גזע עצביים
AGS בתאי גזע עצביים עברו התמיינות התקשורת במשך 4 ימים, טען אז עבור 17 ימים נוספים לפני תיקון ב Neuralife. תאים תוקנו עם paraformaldehyde 4% ו נוירונים שזוהו באמצעות TUJ1 נוגדן ראשוני (Covance) ו אלקסה פלואוריד 568 נוגדנים משני (ירוק) מתוך Invitrogen. Hoechst לצבוע 33343 התווסף כתם כל גרעינים (כחול). מספר סלולרי, מספר נוירון יחס נוירון נקבעו באמצעות תוכנת תולדה neurite ואת מכשיר Arrayscan מ Cellomics. תמונה זו מייצגת כ 57% נוירונים. הגדלה 10X

איור 3. Neuron מספרים ויחס Neuron של רמות תאים AGS גזע עצביים בשלושתרבות הגילאים
AGS בתאי גזע עצביים עברו התמיינות התקשורת במשך 4 ימים, ולאחר מכן נשמר Neuralife ימים 12, 15 ו 17 לפני תיקון. תאים היו קבועים נוירונים המזוהה עם נוגדן TUJ1 הראשי (Covance). Hoechst לצבוע התווסף כתם כל הגרעינים לזיהוי תאים הכולל. מספר סלולרי, מספר נוירון נוירון ועל יחס אחוזים נקבעו באמצעות תוכנת תולדה neurite ואת מכשיר Arrayscan מ Cellomics. הערכים מייצגים ממוצע של 15 בארות לכל מצב + SD.

1. טבלה לדוגמה חישובים המשמשים passaging וזריעה

1. שימוש 700,000 תאים / מ"ל ​​ההשעיה תא
2. שימוש צפיפות התאים של 75,000 תאים / מ"ל ​​או 15,000 תאים לכל טוב של 0.2 נפח מ"ל היטב כל אחד.
3. Inoculating 96 בארות 0.2 מ"ל לכל טוב מ"ל = 21 מ"ל או 19.2 נפח הסופי הרצוי.
4. (ריכוז סופי x נפח סופי) ÷ ריכוז ראשוני = ראשוני נפח
   (21 מ"ל x 75,000 תאים / מ"ל) ÷ 700,000 = 2.25 מ"ל
5. נפח FBS ההשעיה התא. 2.25 מ"ל = 2.25 x 0.05 מ"ל = 0.1125 מ"ל
6. נפח FBS הדרושים 21 מ"ל = 21 מ"ל = 0.42 x 0.02 מ"ל
7. נפח FBS להוסיף בינוני התמיינות = 0.42 מ"ל - 0.1125 מ"ל = 0.3075 מ"ל
8. נפח בינוני התמיינות = 21 מ"ל - 2.25 תא מ"ל השעיה - 0.3075 מ"ל 5% FBS = 18.44 מ"ל.
9. שלב התמיינות בינונית 18.44 מ"ל עם 0.308 מ"ל FBS ולהוסיף 2.25 מ"ל של השעיה התא.

Discussion

AGS תאים בוגרים גזע עצביים הם חזקים והוא יכול להיות מורחבת קטעים רבים שהופך אותם מקור מצוין בתאי גזע עצביים ללימוד בסיסי של תכונות תא גזע עצביים. קצב ההתפשטות הוא בערך מוכפל כל עשרים וארבע שעות, אבל תאים אלה חייבים להיות passaged לפני מפגש לכת כי המגע בין תאים תעדיף בידול כ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
agsNSC	Lifeline Cell Technology	FC-0004
agsNSC Expansion kit	Lifeline Cell Technology	LL-0008	Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com)
agsNSC differentiation kit	Lifeline Cell Technology	LL-0009	Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com)
NeuraLife maintenance media kit	Lifeline Cell Technology	LL-0012	Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com)
Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber)	Hausser Scientific	1490	http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm
Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates	BD Biosciences	356516	www.bdbiosciences.com
Large orifice pipette tips	Fisher Scientific	02-707-141	Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com