שינויים במורפולוגיה בלוטת החלב ואת הסיכון לסרטן השד אצל חולדות

Summary

פרוטוקול שלנו מתאר כיצד לנתח את בלוטת החלב בטן עכברוש ואיך להכין mounts בלוטת החלב כולו. הוא גם מתאר כיצד לנתח מורפולוגיה בלוטת החלב באמצעות שלוש נקודות קצה (מספר ניצנים סוף סופני, התארכות בידול אפיתל) ולהשתמש התוצאות הללו כדי לחזות את הסיכון לסרטן השד אצל חולדות אשר נחשפו שינויים תזונתיים בתוך הרחם או במהלך prepuberty.

Abstract

מחקרים במודלים של מכרסמים של סרטן השד מראים כי חשיפה לגורמים תזונתיים / הורמונלי במהלך ברחם ותקופות התבגרותם, כאשר בלוטת החלב עובר דוגמנות נרחב מחדש דוגמנות, לשנות את הרגישות קרצינוגן-Induced גידולים החלב. ממצאים דומים תוארו בבני אדם: למשל, משקל לידה גבוה מגביר את הסיכון מאוחר יותר לפתח סרטן שד, ועל הצריכה של סויה בילדות מפחיתה הסיכון לסרטן השד. הוא חשב כי אלה שינויים בתזונה לפני ואחרי לידה לגרום שינויים מורפולוגיים מתמשך בבלוטת החלב אשר בתורו לשנות את הסיכון לסרטן השד בשלב מאוחר יותר בחיים. אלה שינויים מורפולוגיים צפוי לשקף שינויים epigenetic, כגון שינויים מתילציה DNA, ההיסטונים וביטוי מירנה כי אז להשפיע על שעתוק הגנים. במאמר זה אנו מתארים כיצד שינויים במורפולוגיה בלוטת החלב יכול לנבא את הסיכון לסרטן השד אצל חולדות. פרוטוקול שלנו במיוחד מתאר כיצד לנתח ולהסיר את בלוטת החלב בטן עכברוש ואיך להכין mounts בלוטת החלב כולו. הוא גם מתאר כיצד לנתח מורפולוגיה בלוטת החלב פי שלוש נקודות קצה (מספר ניצנים סוף סופני, התארכות בידול אפיתל) וכדי להשתמש בנתונים כדי לחזות את הסיכון לפתח סרטן השד.

Protocol

1. הסרת בלוטת החלב בטן הכנת הר שלם

1. להרדימו על פי הנחיות IACUC. פין החיה על גבו מהרגליים שלה עם מחטים, או קלטת הרגליים על הלוח את פני השטח, ולנגב את העור רטוב עם אתנול (EtOH). הרם את העור קצת עם מלקחיים במספריים חדים לעשות חתך קו האמצע לתוך העור מתחיל בין השניים # 5 הפטמות לחתוך לכיוון הצוואר. בצע חתך Y הפוכה מן קו האמצע לכיוון הרגליים האחוריות. אם בלוטות החלב החזה גם להיות שנאספו, לעשות גם חתך Y מתוך קו האמצע בין זוג # 2 הפטמות כלפי הרגליים הקדמיות.
2. לנתח העור לפתוח במספריים בצד אחד של החתך Y הפוכה לחשוף את בלוטת החלב # 4 בטן; בלוטות החלב מחוברים לעור. הצמד את העור עם מחטים על הלוח את פני השטח, כדי לחשוף לחלוטין את בלוטת. עבודה צד אחד, בלוטת באותה תקופה.
3. לנתח את בלוטת החלב חינם מן העור או במספריים חדים ו / או אזמל, החל באזור הפרוקסימלי קרוב לפטמה ועבודה לקראת סוף דיסטלי של בלוטת כלפי עמוד השדרה של החיה. (זה יכול לקחת מספר דקות, במיוחד עכברוש מבוגר יותר.)
4. להפיץ מיד את בלוטת מנותקת לשקופית זכוכית שכותרתו כראוי (להשתמש בעט ראוי סמן קבע ו / או "עט יהלום"), ולהפיץ את בלוטת המקביל בזהירות לגודלו המקורי וצורתם באתרם. שקופיות הזכוכית חייב להיות גדול יותר בלוטת. לאחר הפצת בלוטת לשקופית, ולתת לו לשבת על השולחן למשך זמן מה, כך בלוטת מקלות לשקופית, אבל לא נותנים לו להתייבש.
5. שים את השקופית לתוך צנצנת המכילה מקבע של Carnoy (75% חומצה אצטית קרחונית, אתנול אבסולוטי 25% = EtOH), תן לו לקבל קבוע בטמפרטורת החדר (RT) בשכונה לרתוח במשך 2 ימים או יותר. שקופיות ניתן גם להשאיר מקבע למשך זמן ארוך יותר.
6. שטפו את השקופיות EtOH 70% במשך שעה 1 ב RT.
7. שטפו במים מזוקקים למשך 30 דקות ב RT.
8. כתם אלום כרמינה כתם *) עבור 2 ימים או יותר (עד שתראה כי בלוטות הלימפה יש מוכתמת דרך; להסתכל על הצד האחורי של השקופית).
9. לשטוף בסדרה הגוברת של EtOH, 1 שעה בכל אחד: 70% -> 95% -> 100%. לאחר לשטוף האחרון מוחלט EtOH את בלוטות קסילן. בואו לשבת למכסה המנוע קטר ב RT לפחות 2 ימים. זה השלב האחרון הוא ניקוי של delipidation משמעות בלוטת החלב של כרית שומן החלב, ולהגדיל הבאים בשקיפות. Fattier בלוטת הוא יותר זמן נדרש ניקוי.
10. הר עם כיסוי תלושי באמצעות התקשורת הרכבה, כגון Permount. בואו שקופיות הבאר היבשה (מספר ימים) לפני התבוננות במיקרוסקופ סטריאו.
    * אלום כרמינה הכתם:
    
    מקום 1 גרם ארגמן (Sigma C1022) ו 2.5 גרם אשלגן אלומיניום גופרתי (Sigma A7167) 500 מ"ל מים מזוקקים להרתיח במשך 20 דקות. התאם את נפח סופי 500 מ"ל מים. סינון במקרר. הפתרון יכול לשמש במשך מספר חודשים. בטל כאשר צבע הופך חלש.

2. ניתוח של החלב מורפולוגיה הר שלם בלוטת

בלוטת החלב כולו מורפולוגיה mounts מנותח על פי הקצה הנקודות הבאות ואת תוצאות בקורלציה עם הסיכון לסרטן השד.

1. בלוטת החלב שלמה הר ב PND 21 (טרום התבגרותם גיל):
   • אפיתל צמיחה:
     • מרחק הפטמה לסוף עץ אפיתל (במילימטרים), נמדד באמצעות סרגל
   • פוטנציאל לשינוי ממאיר:
     • מספר TEBs (ניצנים מסוף סוף), מנה תחת מיקרוסקופ אור. TEBs הם מבנים בולבוסי הגדול ממוקם רק בסוף דיסטלי של עץ אפיתל החלב
   • בידול:
     • Ab1 (מכתשיים ניצן) ציון (0-5). ניצנים מכתשיים פרושים על פני האפיתל.
     • AB2 ציון (0-5)
   
   Mounts שלמים הם הבקיע תחת מיקרוסקופ אור. ערכים הציון מ ab1 ו AB2 מתווספים עבור ציון הבידול הסופי.
2. בלוטת החלב שלמה הר שנאספו PND 50 (שלאחר התבגרותם גיל):
   • אפיתל צמיחה:
     • מרחק הצומת לימפה לסוף עץ אפיתל (במילימטרים), נמדד באמצעות סרגל.
     • מרחק מקצה העץ אפיתל לסוף כרית שומן, נמדד באמצעות סרגל.
   • פוטנציאל לשינוי ממאיר:
     • מספר TEBs, מנה תחת מיקרוסקופ אור
   • בידול:
     • Ab1 ציון (0-5)
     • AB2 ציון (0-5)
     • האוניות ציון (0-5)
   
   Mounts שלמים הם הבקיע תחת מיקרוסקופ אור. בידול יהיה מעריך בשתי דרכים. ראשית, ערכי את הציון מ ab1, AB2 ו האוניות מתווספים עבור ציון התמיינות סופית. בנוסף, היחס בין ציון האוניות ab1 + ציון AB2 יחושב. ABS לבדל את האוניות, ואת גבוה היחס בין האוניות ו-ABS, מובחן יותר בלוטת הוא.

3. מישוש ומדידה סרטן השד אצל חולדות מתאם ל מורפולוגיה בלוטת החלב

1. כדי להתחיל בהליך זה, להחזיק את העכברוש על ידי לתפוס את כל הגוף עם כף היד על הגב, עם האצבע מאחורי הראש ואת האגודל והאצבע השניה תחת השחי הנגדי. הפעל את העכברוש כך שוכב על האחוריים שלה, למשש לזהות גידולים כל החלב; גידולים מוחשית צריך להרגיש כמו "גוש".
2. הבא להשתמש קליפר למדוד את רוחב, אורך וגובה של הגידול. חשב את נפח הגידול באמצעות עוצמת אליפסה, הנוסחה = 1/6πabc, שם 'a' = רוחב, = 'ב' אורך, 'c' גובה =.
3. ידנית להקליט את המיקום והגודל של הגידול במחברת על בסיס שבועי. נתונים אלה יועברו גיליון מאוחר יותר.

4. נציג תוצאות

דיסקציה זהירה של כרית שומן החלב ועיבוד שלה wholemount יאפשר הערכת מצב התפתחותי של בלוטת החלב. כאשר כל שלב הוא נעשה בצורה נכונה, את העץ כולו אפיתל החלב נראה בבירור בתוך כרית שומן, וזה מאפשר קביעה קל של מספר TEBs וחישוב צפיפות של ניצנים ואת האוניות מכתשיים. משגים ב wholemounts הכנת עשויים לכלול אי לנתח את כרית השומן שלם, תיקון מספיק, וניקוי לקוי.

הערכת מורפולוגיה בלוטת החלב יספק מידע על המספר הנוכחי של מבנים יכול להצמיח גידולים החלב (TEBs), מידת הבידול של המבנים אפיתל (ניצנים מכתשיים ו האוניות), ולמדוד את הצמיחה (התארכות ductal). חשוב להפריד TEBs כדי מסתיים במסוף; השנייה ממוקמים בקצה הדיסטלי של האפיתל, בדומה TEBs, אך הם קטנים יותר TEBs ואינם להצמיח גידולים ממאירים. מסתיים Terminal נראים גם בתוך העץ אפיתל.

איור 1:. תוצאה נציג מוכן היטב לעלות בלוטת החלב שלמה כל הרכיבים של בלוטת כבר ניתח כראוי מכתים ארגמן הוא אופטימלי.

איור 2:. תוצאה נציג הר מוכן גרוע בלוטת החלב כולו בלוטת כבר ניתח כראוי (החלק הדיסטלי של בלוטת חסר), לא היה מתוח כראוי delipidation לא קרה לגמרי.

Discussion

הערכה של בלוטת החלב מורפולוגיים נקודות קצה ואת הצמיחה של העץ אפיתל יכול לשמש כדי לחזות אם מניפולציות חייו המוקדמים תזונתיים, או מניפולציות אחרות לשנות בסביבה ברחם או הורמונלי לפני גיל הבגרות המינית, לשנות את הסיכון לסרטן השד מאוחר יותר. מאז סרטן השד בבני אדם היא יזמה במבנים החלב (יחידות מסוף אונתית ductal, TDLUs) דומה TEBs בחולדות, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את הפוטנציאל של החיים חשיפות מוקדם כדי להשפיע על הסיכון לסרטן השד. יתר על כן, אצל נשים mammographic צפיפות גבוהה מגבירה את הסיכון לסרטן השד על ידי קיפול 4-6, והערכת הצמיחה של עץ אפיתל החלב יכול לשמש כדי לזהות גורמים הקובעים צפיפות mammographic וגורמים אשר להפחית את הצפיפות. כדי להשיג מידע זה, בלוטת החלב צריך להיות גזור באופן מלא, מתוח כהלכה על זכוכית שקופית כך שכל מרכיביו ניתן דמיינו תחת מיקרוסקופ. בנוסף, ראוי מכתים ארגמן ו delipidation ב קסילן תספק mounts כל המתאימים הערכת הסיכון לסרטן השד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Electron Microscopy Sciences	AX0073-9	Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol	The Waner-Graham Co.	64-17-5	Carnoy’s Fixative
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022	Carmine solution
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A7167	Carmine solution