Changements dans la morphologie glande mammaire et le risque de cancer du sein chez les rats

Résumé

Notre protocole décrit comment disséquer le rat des glandes mammaires et abdominales comment préparer monte glande mammaire ensemble. Il décrit également la façon d'analyser la morphologie des glandes mammaires à partir de trois points d'extrémité (nombre de bourgeons extrémité terminale, l'élongation et la différenciation épithéliale) et d'utiliser ces résultats pour prédire le risque de cancer mammaire chez les rats qui ont été exposés à des modifications diététiques In utero Ou pendant prépuberté.

Résumé

Des études dans des modèles rongeurs d'un cancer du sein montrent que l'exposition à des facteurs alimentaires / hormonaux pendant la période in utero et pubertaire, lorsque la glande mammaire subit la modélisation vaste et re-modélisation, de modifier la sensibilité aux carcinogènes induits des tumeurs mammaires. Des constatations similaires ont été décrits chez l'homme: par exemple, poids élevé augmente le risque ultérieur de développer un cancer du sein, et l'apport alimentaire de soja durant l'enfance diminue le risque de cancer du sein. On pense que ces modifications prénatals et postnatals alimentaires induisent des changements morphologiques persistant dans la glande mammaire qui à leur tour modifier le risque de cancer du sein plus tard dans la vie. Ces changements morphologiques reflètent probablement des modifications épigénétiques, comme des changements dans la méthylation de l'ADN, les histones et l'expression du miARN qui affectent alors la transcription des gènes. Dans cet article nous décrivons comment les changements dans la morphologie des glandes mammaires peut prédire le risque de cancer mammaire chez les rats. Notre protocole décrit précisément comment disséquer et enlever la glande abdominale du rat mammaire et la façon de préparer monte glande mammaire ensemble. Il décrit également la façon d'analyser la morphologie des glandes mammaires en fonction de trois points d'extrémité (nombre de bourgeons extrémité terminale, l'élongation et la différenciation épithéliale) et d'utiliser les données pour prédire le risque de développer un cancer mammaire.

Protocole

1. Ablation de la glande mammaire et abdominale Préparation d'un mont entier

1. Euthanasier l'animal selon les directives du IACUC. Pin de l'animal sur le dos de ses jambes avec des aiguilles, ou du ruban adhésif les jambes sur le bord de surface, et essuyer la peau mouillée avec de l'éthanol (EtOH). Soulever la peau un peu avec des pinces et de ciseaux pointus faire une incision médiane dans la peau de départ entre la paire n ° 5 mamelons et couper vers le cou. Faire une incision Y inversé de la ligne médiane vers les pattes postérieures. Si les glandes mammaires thoraciques doivent également être recueillis, font aussi une incision Y de la ligne médiane entre la paire n ° 2 mamelons vers les pattes avant.
2. Disséquer la peau avec des ciseaux ouverts sur un côté de l'incision Y inversé pour exposer la glande abdominale # 4 mammaire; les glandes mammaires sont attachés à la peau. Pin de la peau avec des aiguilles sur le bord de surface, complètement exposer la glande. Le travail d'un côté et la glande à l'époque.
3. Disséquer la glande mammaire gratuite à partir de la peau soit en utilisant des ciseaux pointus et / ou d'un scalpel, à partir de la zone proximale proche de l'embout et le travail vers l'extrémité distale de la glande vers la colonne vertébrale de l'animal. (Cela peut prendre plusieurs minutes, surtout dans un vieux rat.)
4. Immédiatement répandre la glande détachée sur une lame de verre convenablement étiquetés (utilisation d'un marqueur approprié permanente et / ou 'un stylo diamant »), et la propagation de la glande attentivement correspondant à sa taille d'origine et la forme in situ. La lame de verre doit être plus grand que la glande. Après la diffusion de la glande sur la lame, laissez-le reposer sur la table pour un moment, alors que la glande bâtons sur la lame, mais ne laissez pas sécher.
5. Mettez le glisser dans un bocal contenant fixateur de Carnoy (75% d'acide acétique glacial, 25% d'éthanol absolu = EtOH), laissez-vous fixé à température ambiante (TA) dans la hotte pour 2 jours ou plus. Les diapositives peuvent aussi être laissé dans le fixateur pour une plus longue période de temps.
6. Laver les lames dans EtOH à 70% pendant 1 heure à température ambiante.
7. Rincer à l'eau distillée pendant 30 min à température ambiante.
8. Colorer dans une tache de carmin d'alun *) pour 2 jours ou plus (jusqu'à ce que vous voyez que les ganglions lymphatiques ont taché grâce, regardez à l'arrière de la lame).
9. Laver en série croissante d'EtOH, 1 heure dans chaque: 70% -> 95% -> 100%. Après le dernier lavage dans EtOH absolu mettre les glandes dans le xylène. Laissez reposer dans la hotte en RT au moins pour 2 jours. Cette dernière étape est la compensation de la délipidation sens glande mammaire de la plaquette mammaires graisse, et augmentation subséquente de la transparence. La plus grasse de la glande est le plus long temps de compensation est nécessaire.
10. Monter avec des lamelles en utilisant un média de montage, comme Permount. Laissez bien sécher les diapositives (plusieurs jours) avant d'observer sous un microscope stéréo.
    * Alun Carmine taches:
    
    Placer 1 g de carmin (Sigma C1022) et 2,5 g de sulfate de potassium en aluminium (Sigma A7167) dans 500 ml d'eau distillée et faire bouillir pendant 20 min. Ajuster le volume final à 500 ml avec de l'eau. Filtre et réfrigérer. Solution peut être utilisée pendant plusieurs mois. Jetez quand la couleur devient faible.

2. L'analyse de la morphologie mammaire Gland mont entier

Mammaire toute la glande monte morphologie est analysée selon les critères suivants end-points et les résultats en corrélation avec le risque de cancer mammaire.

1. Glande mammaire toute monture au PND 21 (pré-pubères âge):
   • De croissance épithélial:
     • Distance de la tétine à la fin de l'arbre épithéliales (en millimètres), mesurée à l'aide d'une règle
   • Potentiel de transformation maligne:
     • Nombre de TEBS (bourgeons extrémité terminale), comptés sous un microscope optique. TEBS sont les plus grandes structures bulbeuses situé à seulement à l'extrémité distale de l'arbre épithéliales mammaires
   • Différenciation:
     • AB1 (alvéolaire bourgeon) score (0-5). Bourgeons alvéolaires sont réparties à travers l'épithélium.
     • AB2 score de (0-5)
   
   Monte Entières sont marqués d'un microscope optique. Les valeurs de score d'AB1 et AB2 sont ajoutés pour un score de différenciation finale.
2. Glande mammaire toute monture collectées au PND 50 (post-pubères âge):
   • De croissance épithélial:
     • Distance à partir du noeud lymphatique à la fin de l'arbre épithéliales (en millimètres), mesurée à l'aide d'une règle.
     • Distance de la pointe de l'arbre de l'épithélium à la fin du coussinet adipeux, mesurée à l'aide d'une règle.
   • Potentiel de transformation maligne:
     • Nombre de TEBS, comptés sous un microscope optique
   • Différenciation:
     • AB1 score de (0-5)
     • AB2 score de (0-5)
     • Score lobules (0-5)
   
   Monte Entières sont marqués d'un microscope optique. La différenciation sera évalue de deux manières. Tout d'abord, les valeurs score de AB1, AB2 et lobules sont ajoutés pour un score de différenciation finale. En outre, le ratio entre le score lobules et AB1 AB2 + score sera calculé. ABs différencier pour lobules, et plus le rapport entre les lobules et ABS, le plus différencié de la glande est.

3. La palpation et la mesure de tumeur mammaire chez le rat et la corrélation de la morphologie glande mammaire

1. Pour commencer cette procédure, maintenez le rat en saisissant l'ensemble du corps avec la paume sur le dos, avec l'index derrière la tête et le pouce et le majeur sous l'aisselle opposée. Tournez le rat il est couché sur son postérieur, et palper pour détecter toute tumeurs mammaires, tumeurs palpables devrait se sentir comme un «forfaitaire».
2. Suivant l'utilisation d'un pied à mesurer la largeur, la longueur et la hauteur de la tumeur. Calculez le volume de la tumeur en utilisant la formule ellipsoïde, Volume = 1/6πabc, où 'a' = largeur, la longueur 'b' =, et 'c' = hauteur.
3. Enregistrer manuellement l'emplacement et la taille de la tumeur dans un carnet sur une base hebdomadaire. Ces données seront transférées vers un tableur tard.

4. Les résultats représentatifs

Une dissection minutieuse du pad mammaires graisse et son traitement au wholemount permettra d'évaluer l'état de développement de la glande mammaire. Lorsque chaque étape est effectuée correctement, l'ensemble des arbres épithéliales mammaires est clairement visible dans le coussinet adipeux, ce qui permet de déterminer facilement le nombre de TEBS et le calcul de la densité des bourgeons alvéolaires et lobules. Faux pas dans les échantillons entiers préparation peut inclure l'échec de disséquer le pavé toute la graisse, la fixation insuffisante, et la compensation inadéquate.

Évaluation de la morphologie de la glande mammaire va fournir des informations sur le nombre de présents des structures qui peuvent donner lieu à des tumeurs mammaires (TEBS), le degré de différenciation des structures épithéliales (bourgeons alvéolaires et lobules), et mesure de la croissance (élongation canalaire). Il est important de séparer TEBS aux extrémités terminales; ces derniers sont situés à l'extrémité distale de l'épithélium, à l'instar TEBS, mais ils sont plus petits que TEBS et ne donnent pas naissance à des tumeurs malignes. Extrémités terminales sont également vus dans l'arbre épithéliales.

Figure 1:. Résultat représentatif du bien préparés monter la glande mammaire de toute Tous les composants de la glande ont été correctement disséqués et coloration carmin est optimale.

Figure 2:. Résultat représentatif d'une monture mal préparés glande mammaire toute la glande a été correctement disséquées (la partie distale de la glande est manquante), n'a pas été correctement tendue et délipidation n'a pas complètement eu lieu.

Discussion

Évaluation de la glande mammaire morphologique points d'extrémité et la croissance de l'arbre épithéliales peut être utilisé pour prédire si des manipulations diététiques début de la vie, ou d'autres manipulations qui modifient l'environnement in utero ou prépubères hormonaux, de modifier le risque de cancer plus tard mammaire. Puisque le cancer du sein chez l'homme est initié dans les structures mammaires (unités terminales lobulaire canalaire, TDLUs) similaire à TEBS chez le rat, cette technique peut être utilisée pour déterminer le potentiel de l'exposition précoce à affecter le risque de cancer du sein. En outre, chez les femmes de haute densité mammographique augmente le risque de cancer du sein par 4-6 fois, et l'évaluation de la croissance des arbres épithéliales mammaires peuvent être utilisés pour identifier les facteurs qui déterminent la densité mammographique et des facteurs qui réduisent cette densité. Pour obtenir cette information, la glande mammaire devrait être entièrement disséqué, bien tendue sur une lame de verre afin que tous ses composants peuvent être visualisées sous un microscope. En outre, bon coloration carmin et délipidation dans le xylène fournira monte entier qui sont adaptés à l'évaluation du risque de cancer mammaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Electron Microscopy Sciences	AX0073-9	Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol	The Waner-Graham Co.	64-17-5	Carnoy’s Fixative
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022	Carmine solution
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A7167	Carmine solution