Alterações na morfologia da glândula mamária e risco de câncer de mama em ratos

Resumo

Nosso protocolo descreve como dissecar o rato glândula mamária e abdominal como preparar montagens glândula mamária todo. Ele também descreve como analisar a morfologia da glândula mamária por meio de três pontos finais (número de gemas fim terminal, alongamento e diferenciação epiteliais) e usar estes resultados para prever o risco de câncer mamário em ratos que foram expostos a modificações dietéticas In utero Ou durante a pré-puberdade.

Resumo

Estudos em modelos de roedores de câncer de mama mostram que a exposição aos fatores dietéticos / hormonal durante o in utero e períodos de puberdade, quando a glândula mamária sofre de modelagem ampla e remodelação, alterar a susceptibilidade a substância cancerígena induzida por tumores mamários. Achados similares têm sido descritas em seres humanos: por exemplo, peso elevado aumenta mais tarde risco de desenvolver câncer de mama e ingestão de soja durante a infância diminui risco de câncer de mama. Pensa-se que essas modificações na dieta pré-natal e pós-natal persistente induzir mudanças morfológicas na glândula mamária que por sua vez, modificar o risco de câncer de mama mais tarde na vida. Essas mudanças morfológicas provavelmente refletem modificações epigenéticas, tais como alterações na metilação do DNA, histonas e expressão miRNA que então afetam a transcrição do gene. Neste artigo vamos descrever como as mudanças na morfologia da glândula mamária pode prever risco de câncer de mama em ratos. Nosso protocolo descreve especificamente como dissecar e remover a glândula abdominal de ratos mamária e como preparar montagens glândula mamária todo. Ele também descreve como analisar a morfologia da glândula mamária de acordo com três pontos finais (número de gemas fim terminal, alongamento e diferenciação epiteliais) e usar os dados para prever o risco de desenvolver câncer de mama.

Protocolo

1. A remoção da glândula mamária e abdominal Preparando um monte inteiro

1. Eutanásia do animal de acordo com as diretrizes IACUC. Pin o animal à sua volta de suas pernas com agulhas, ou fita as pernas em cima da prancha de superfície, e limpe a pele molhada com etanol (EtOH). Levante a pele um pouco com uma pinça e com tesoura afiada fazer uma incisão mediana na pele de partida entre os dois mamilos # 5 e cortou para o pescoço. Faça uma incisão Y invertido a partir da linha média para as pernas traseiras. Se torácica glândulas mamárias também estão a ser recolhidos, fazer também uma incisão Y da linha média entre o par # 2 mamilos para as pernas da frente.
2. Dissecar a pele com uma tesoura aberta em um lado da incisão Y invertido para expor a glândula abdominal # 4 mamária; as glândulas mamárias estão ligados à pele. Pinos na pele com agulhas na placa de superfície, para exposição da glândula. Trabalho de um lado e da glândula no momento.
3. Dissecar a glândula mamária livre da pele ou usando uma tesoura afiada e / ou um bisturi, a partir da área proximal perto do mamilo e trabalhar no sentido da extremidade distal da glândula em direção a espinha dorsal do animal. (Isto pode demorar vários minutos, especialmente em um velho rato.)
4. Imediatamente espalhou a glândula destacada em uma lâmina de vidro devidamente rotulados (use uma caneta apropriada permanente e / ou "uma caneta de diamante"), e espalhe cuidadosamente a glândula correspondente ao seu tamanho original e forma in situ. A lâmina de vidro deve ser maior do que a glândula. Depois de espalhar a glândula para o slide, deixe-o sentar na mesa por um tempo, para que a glândula varas para o slide, mas não deixe secar.
5. Coloque o slide em um frasco contendo fixador de Carnoy (75% de ácido acético glacial, 25% etanol absoluto = EtOH), permita que ela se fixa à temperatura ambiente (RT) na capela de dois dias ou mais. Slides também podem ser deixadas no fixador por um longo período de tempo.
6. Lavar as lâminas em EtOH 70% por 1 hora em temperatura ambiente.
7. Enxágüe em água destilada por 30 min em temperatura ambiente.
8. Mancha em Alum Carmine mancha *) para 2 dias ou mais (até ver que os gânglios linfáticos têm manchado através; olhar para o lado de trás do slide).
9. Lavar em série crescente de etanol, 1 hora em cada um: 70% -> 95% -> 100%. Após a última lavagem em termos absolutos EtOH colocar as glândulas em xileno. Vamos sentar-se na capela da TR pelo menos por dois dias. Este último passo é limpar da glândula mamária delipidation significado do pad mamárias gordura, e subsequente aumento da transparência. O fattier da glândula é o mais longo tempo de compensação é necessária.
10. Monte com cobertura desliza usando uma mídia de montagem, como Permount. Deixe secar bem os slides (vários dias) antes de observar em um microscópio estéreo.
    * Alum Carmine Stain:
    
    Colocar 1 g de carmim (Sigma C1022) e 2,5 g de sulfato de potássio alumínio (Sigma A7167) em 500 mL de água destilada e ferver durante 20 min. Ajustar o volume final de 500 mL com água. Filtrar e refrigerar. Solução pode ser usada por vários meses. Descartar quando a cor se torna fraco.

2. Análise da morfologia mamária Monte Gland Whole

Glândula mamária toda morfologia monta é analisado de acordo com os seguintes pontos finais e os resultados correlacionados com o risco de câncer mamário.

1. Glândula mamária toda montagem de PND 21 (pré-púberes idade):
   • Crescimento epitelial:
     • Distância do mamilo até o fim da árvore epiteliais (em milímetros), medida com uma régua
   • Potencial de transformação maligna:
     • Número de TEBS (brotos fim terminal), contados em microscópio de luz. TEBS são as maiores estruturas bulbosa localizado apenas na extremidade distal da árvore mamárias epiteliais
   • Diferenciação:
     • AB1 pontuação (alveolar bud) (0-5). Buds alveolares são espalhados por todo o epitélio.
     • AB2 pontuação (0-5)
   
   Monta conjuntos são marcados com um microscópio de luz. Os valores de pontuação de AB1 e AB2 são adicionadas para uma pontuação diferenciação final.
2. Glândula mamária todo-mount coletados no PND 50 (pós-púberes idade):
   • Crescimento epitelial:
     • Distância do nó de linfa até o fim da árvore epiteliais (em milímetros), medida usando uma régua.
     • Distância da ponta da árvore epiteliais para o fim da gordura abdominal, medida usando uma régua.
   • Potencial de transformação maligna:
     • Número de TEBS, contados em microscópio de luz
   • Diferenciação:
     • AB1 pontuação (0-5)
     • AB2 pontuação (0-5)
     • Lóbulos pontuação (0-5)
   
   Monta conjuntos são marcados com um microscópio de luz. Diferenciação será avalia de duas maneiras. Primeiro, os valores de pontuação AB1, AB2 e lóbulos são adicionadas para uma pontuação diferenciação final. Além disso, a relação entre lóbulos pontuação e + AB1 AB2 pontuação será calculada. ABs para diferenciar lóbulos, e quanto maior a taxa entre os lóbulos e ABS, o mais diferenciado da glândula é.

3. Palpação e medição do tumor mamário em ratos e Correlação de Morfologia da glândula mamária

1. Para iniciar este procedimento, segure o rato, segurando todo o corpo com a palma da mão sobre as costas, com o indicador por trás da cabeça eo polegar eo segundo dedo sob a axila oposta. Ligue o rato para que ele esteja mentindo sobre o seu posterior, e apalpar para detectar tumores mamários; tumores palpáveis ​​deve se sentir como um "caroço".
2. Em seguida use um paquímetro para medir a largura, comprimento e altura do tumor. Calcular o volume tumoral utilizando a fórmula de elipsóide Volume, = 1/6πabc, onde 'a' = largura, comprimento 'b' = e 'c' height =.
3. Registrar manualmente a localização eo tamanho do tumor em um notebook em uma base semanal. Estes dados serão transferidos para uma planilha mais tarde.

4. Resultados representante

Dissecção cuidadosa da almofada mamárias gordura e seu processamento para wholemount vai permitir a avaliação do estado de desenvolvimento da glândula mamária. Quando cada passo é feito corretamente, a árvore inteira epiteliais mamárias é claramente visível dentro do bloco de gordura, e isto permite a determinação fácil de o número de TEBS e cálculo da densidade de brotos alveolar e lóbulos. Erros em wholemounts preparando podem incluir a falha de dissecar o bloco inteiro de gordura, fixação insuficiente, inadequada e limpeza.

Avaliação da morfologia da glândula mamária irá fornecer informações sobre o número das actuais estruturas que podem dar origem a tumores mamários (TEBS), grau de diferenciação das estruturas epiteliais (brotos alveolar e lóbulos), ea medida do crescimento (alongamento ductal). É importante separar TEBS para fins terminal, este último estão localizados na extremidade distal do epitélio, à semelhança do TEBS, mas eles são menores do que TEBS e não dar origem a tumores malignos. Termina terminal também são vistos dentro da árvore epiteliais.

Figura 1:. Resultado Representante do bem preparado montar toda glândula mamária Todos os componentes da glândula foram devidamente dissecados e coloração carmim é o ideal.

Figura 2:. Representante resultado de uma montagem de todo mal preparados glândula mamária A glândula foi devidamente dissecado (a porção distal da glândula em falta), não foi devidamente esticada e delipidation não foi completamente ocorreu.

Discussão

Avaliação morfológica da glândula mamária de pontos finais e do crescimento da árvore epitelial pode ser usado para prever se manipulações início da vida na dieta, ou outras manipulações que alteram no útero ou pré-púberes ambiente hormonal, modificar o risco de câncer de mama mais tarde. Como o câncer de mama em humanos seja iniciada em estruturas mamárias (unidades de terminal lobular ductal, TDLUs) semelhante ao TEBS em ratos, esta técnica pode ser usada para determinar o potencial de exposição precoce a afetar o risco de câncer de mama. Além disso, em mulheres de alta densidade mamográfica aumenta o risco de câncer de mama por 4-6 vezes, e avaliação do crescimento da árvore epiteliais mamárias pode ser usado para identificar os fatores que determinam densidade mamográfica e os fatores que reduzem a esta densidade. Para obter essas informações, glândula mamária deve ser totalmente dissecado, devidamente esticado sobre uma lâmina de vidro, para que todos os seus componentes podem ser visualizadas em um microscópio. Além disso, a coloração carmim adequada e delipidation em xileno irá fornecer toda monta que são adequados para avaliação de risco de câncer mamário.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Electron Microscopy Sciences	AX0073-9	Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol	The Waner-Graham Co.	64-17-5	Carnoy’s Fixative
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022	Carmine solution
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A7167	Carmine solution