בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Summary

פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד של בתאי גזע מבלוטת הרוק עכבר מתואר. שיטה מעסיקה עיכול אנזימטי מכני, והיתרי הבידוד של salispheres המכילה תאים בעלי מאפיינים של בתאי גזע.

Abstract

בלוטות הרוק הן מבוגרות ממוצא אנושי עכבר מהווים מינימום של חמישה סוגי תאים, שכל אחד מהם מאפשר ייצור והפרשה של הרוק לחלל הפה. תאים acinar הצפק ו רירי הם חלבונים מפעלים לייצור הרירי של בלוטת בהתאמה, המייצגים את מקורו של ייצור הרוק. מסונתז פעם, המרכיבים השונים proteinaceous האנזימטית אחרים של רוק מופרשים דרך סדרה של תאים אפיתל ductal נושאות מסוג מורפולוגיה, עד הגירוש הסופי של הרוק דרך צינור אחד גדול לתוך חלל הפה. הרכב הרוק הוא שונה גם על ידי תאים ductal במהלך תהליך זה.

בשנת ביטוי של מחלות כגון תסמונת סיוגרן, ובכמה מצבים קליניים כגון טיפול הקרנות לסרטן הראש והצוואר, ייצור רוק על ידי בלוטות מצטמצם באופן דרמטי ^1,2. Xerostomia וכתוצאה מכך, תחושה סובייקטיבית של יובש בפה, משפיע לא רק על היכולת של החולה לבלוע ולדבר, אלא גם מעודדת את התפתחות עששת שיניים יכול להיות מתיש חברתית הסובל.

שיקום ייצור הרוק הנ"ל תנאים קליניים ולכן מהווה צורך קליני מסופקים, וכן מספר מחקרים כאלה הוכיחו את יכולת ההתחדשות של בלוטות הרוק ^3-5. בהמשך בידודה של דמוי תא גזע אוכלוסיות של תאים מרקמות שונות בתוך העכבר גופות אדם ^6-8, הראינו באמצעות השיטה המתוארת כי תאי גזע שבודדו בלוטות הרוק העכבר יכול לשמש כדי להציל את ייצור הרוק הרוק מוקרן בלוטות ^9,10. תגלית זו סוללת את הדרך לפיתוח טיפולים מבוססי תאים גזע לטיפול התנאים xerostomic בבני אדם, וגם חקר של בלוטת הרוק כמו microenvironment המכילה תאים בעלי יכולת חידוש עצמי multipotent.

Protocol

1. ריג'נט הכנה

1. הצפת: 1% (w / v) בסרום שור אלבומין תמיסת מלח מאוזנת של האנק
2. אנזימים מחדש. אנזים Hyaluronidase: 40 מג / מ"ל, מומס חיץ. Collagenase II: 23mg / mL, מומס חיץ. השתמש טרי פתרונות אנזים מוכן טרי בידוד כל אחד. כאשר מומס, לאחסן ב 4 ° C עד השימוש לעיכול.
3. 50 mM סידן כלוריד במים מזוקקים. סנן לעקר דרך פילטר בגודל 0.2 UM הנקבוביות.
4. עכבר בלוטת הרוק (MSG) בינוני תרבות: DMEM: F12 עם פניצילין (100 IU / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), glutamax (2 מ"מ), גידול אפידרמיס גורם-2 (20 ng / mL), גורם הגדילה פיברובלסטים אינסולין -2 (20 ng / mL), N2 תוספת (1%), (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו dexamethasone (1 מיקרומטר).

2. רקמות מכונות עיכול אנזימתי

1. לשקול את בלוטות הרוק גזור.
2. קוצצים בלוטות לתערובת הומוגנית באמצעות מספריים סטרילי לנתיחה מעוקל בצלחת פטרי קטנות.
3. איסוף רקמות טחון ב 14 צינורות מ"ל, באמצעות 1mL של חיץ לכל רקמה submandibular 80mg. שוטפים את בצלחות פטרי נקי של רקמה בעזרת כמה למאגר.
4. הוסף 1 מ"ל של חיץ לכל רקמה 80 מ"ג, ואחריו פתרון אנזים 25 μL II collagenase, 25 פתרון μL אנזים hyaluronidase ו 250 סידן כלוריד μL פתרון לכל רקמה 80 מ"ג. אם עובדים עם כמויות גדולות של רקמה, צעדים 2.4-2.9 ניתן לבצע T25 תרבות צלוחיות רקמות לנוחות.
5. מדגירים את waterbath רועד להגדיר 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לתערובת אנזים ביסודיות דרך רקמות שוב.
6. החלף ב waterbath לעוד 20 דקות.
7. איסוף רקמה על ידי צנטריפוגה ב XG 400, למשך 8 דקות. בטל supernatant.
8. Resuspend במאגר 2 מ"ל של כל רקמות 80 מ"ג, ולחזור האנזים סידן כלוריד בנוסף לעיל. דגירה 20 דקות באמבט מים רועד. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לערבב אנזימים ביסודיות.
9. דגירה של 20 דקות האחרון רועד אמבט מים. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה לעיל, להשליך supernatant.

3. כביסה שלבים

1. Resuspend כל 80 מ"ג של רקמות החיץ 2 מ"ל ו פיפטה לשטוף רקמה חופשית של אנזימים.
2. צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant.
3. חזור על לשטוף באמצעות חיץ 1 מ"ל לכל רקמה 80 מ"ג. צנטריפוגה לאסוף, להשליך supernatant.

4. סינון

1. Resuspend פתרון רקמות החיץ 1 מ"ל לכל רקמה 80 מ"ג.
2. הוספת הפתרון לסינון 100 מיקרומטר נקבוביות בגודל ממוקמים מעל הצינור פלקון 50 מ"ל. אין ליישם יותר מ -3 MLS של פתרון רקמות טחון לכל עמודה, כמו מסנני עלול להיחסם. אפשר לחלחל. הסרת חומר מסונן תלוי התחתון של סינון לפי פיפטה, ומוסיפים תסנין.
3. השתמש במזרק עם מחט 26 מד לקחת תסנין מ 50 מ"ל צינורות חלים 50 מיקרומטר מסננים גודל הנקבוביות על 5 צינורות מ"ל. אפשר לסנן דרך, סיוע על ידי שחרור מכסים במידת הצורך.
4. צינורות צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant.

5. ציפוי ובינוניים

1. מערבבים את כל הגרגרים לתוך בכרך אחד. ספירה באמצעות מונה תא haemocytometer אוטומטיות או.
2. תאים פלייט בצפיפות של 0.4 x 10 ⁶ תאים לכל גם צלחת 12 היטב, או 2.67 x 10 ⁶ תאים לכל בקבוק T25 בתרבית רקמה. הוסף 1 מ"ל MSG בינוני עד טוב כל או 6 מ"ל ל T25 כל בקבוק.
3. לדגור על 37 ° C. Spheres צריך להיות לעין ביום 2.

6. נציג תוצאות:

אחרי יומיים שלושה בתרבות, אגרגטים של תאים קטנים (salispheres) יהיה ניכר התרבויות. Salispheres ימשיך לגדול בגודל על פני תקופה של עשרה ימים בתרבות. נציג בניגוד לשלב תמונות של מיקרוסקופיה salispheres מוצגים באיור 1. התאים מתרבים להביע תא גזע חלבונים הקשורים הסמן יכול להיות מבודד בתחומים אלה, בצורה אופטימלית בין בידוד 3-5 שלאחר ימים, ומסוגלים הבחנה לתוך תפקודית, רוק לייצר תאים acinar.

באיור 1. היווצרות Salisphere במבחנה. בעקבות עיכול מכני אנזימטיות באמצעות פרוטוקול הנוכחי, תחומי הגדלת גודל ניתן למצוא בתרבויות צף. לוחות מייצגים בניגוד שלב מיקרוסקופיה תמונות של תחומים מהימים 0 (א), 4 (ב), 7 (ג) ו 10 (ד). בר סולם = 50 מיקרומטר.

Discussion

השיטה המתוארת כאן בתרבית רקמה מייצג פרוטוקול לשחזור עבור בידוד של התא המכיל גזע salispheres מ בלוטות הרוק של עכברים. מחקרים באמצעות תאים מבודדים בצורה זו הדגישו את יכולת ההתחדשות של בלוטת הרוק בתאי גזע ^9. השתלה של 100 של c-Kit + בתאים שמקורם salispheres המושרה התאוששות תפקודית של בלוטות הרוק עכבר מוקרן. נתונים אלה מרגש לספק נקודת התחלה עבור החקירה של טיפול בתאי גזע מבוסס על xerostomia. אפיקים רבים להישאר כדי להיחקר עם זאת, כולל את פרופיל ביטוי מלא חלבון סמן של בתאי גזע, היכולת של בלוטות submandibular להציל את תפקוד בלוטות הרוק הפרוטיד מוקרן ולהיפך, ואת האפיון של המשוערת בנישה של תא גזע vivo התאים. בסופו של דבר, את התרגום של פרוטוקול זה דגימות רקמה אנושית ואת הפוטנציאל הבאים לטיפול של xerostomia בחולים אנושיים באמצעות תאים מבודדים הוא היישום המלהיב ביותר של השיטה המתוארת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Store at – 20 °C
Collagenase II	GIBCO, by Life Technologies	17101-015	Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2	Sigma-Aldrich	E9644	Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2	Sigma-Aldrich	F0291	Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement	GIBCO, by Life Technologies	17502-048	As manufacturer instructions.
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers	BD Biosciences	352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size)	BD Biosciences	352235