Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Резюме

Оптимизированный протокол для выделения стволовых клеток из мыши слюнной железы описана. Метод использует ферментативной и механической пищеварение, и позволяет изоляции salispheres содержащие клетки с характеристиками стволовых клеток.

Аннотация

Зрелые слюнных желез как человеческие, так и мышь происхождения составляют менее пяти типов клеток, каждый из которых обеспечивает производство и выделение слюны в полости рта. Серозный и клеток слизистой ацинарных являются белков и слизистых заводы железы, соответственно, и представляют происхождение выработку слюны. Как только синтезируется, различные ферментативные и другие белковые компоненты слюны выделяются через ряд протоков эпителиальных клеток, несущих типа морфологии, до возможной высылке слюной через один крупный канал в полость рта. Состав слюны также влияет протоков клеток во время этого процесса.

В проявлением таких заболеваний, как синдром Шегрена, а в некоторых клинических ситуациях, таких как лучевая терапия для лечения рака головы и шеи, слюны производства желез резко сокращается ^1,2. В результате сухость во рту, субъективное ощущение сухости во рту, влияет не только на способности пациента глотать и говорить, но и способствует развитию кариеса зубов и может быть социально изнурительных для больного.

Восстановление выработку слюны в вышеупомянутых клинических состояний, следовательно, представляет неудовлетворенных клинической необходимости, и в этом качестве несколько исследований показали, регенеративная способность слюнных желез ^3-5. В дополнение к изоляции стволовых клеток, как популяций клеток из различных тканей в мыши и человеческих тел, ^6-8, мы показали, описанным способом, что стволовые клетки, выделенные из мыши слюнных желез могут быть использованы, чтобы спасти производство слюны при облучении слюнных желез ^9,10. Это открытие открывает путь к развитию на основе стволовых клеток терапий для лечения xerostomic условиях в организме человека, а также для исследования слюнных желез, как микросреда, содержащих клетки с мультипотентные самообновлению возможностей.

протокол

1. Регент подготовка

1. Буфер: 1% (м / о) бычьего сывороточного альбумина в сбалансированном солевом растворе Хэнка
2. Развести ферментов. Гиалуронидаза фермента: 40 мг / мл, растворяют в буфере. Коллагеназы II: 23mg / мл, растворяют в буфере. Используйте свежеприготовленные фермента решения свежей для каждого изоляции. При растворении, хранить при 4 ° С до использования для пищеварения.
3. 50 мМ хлорида кальция в дистиллированной воде. Фильтры стерилизовать через 0,2 мкм поры фильтра размера.
4. Мышь слюнной железы (MSG) культуральная среда: DMEM: F12 с пенициллином (100 МЕ / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), glutamax (2 мМ), эпидермальный фактор роста-2 (20 нг / мл), фактор роста фибробластов -2 (20 нг / мл), N2 дополнение (1%), инсулин (10 мкг / мл) и дексаметазоном (1 мкМ).

2. Механические и ферментативной тканей Пищеварение

1. Взвесьте расчлененный слюнных желез.
2. Чоп желез в однородную целлюлозы с использованием стерильных изогнутые ножницы рассечение в маленькой чашке Петри.
3. Сбор измельченной ткани в 14 мл трубы, с помощью 1 мл буфера в 80 мг подчелюстной ткани. Полоскание чашки Петри чистой ткани, используя некоторые из буфера.
4. Добавьте еще 1 мл буфера на 80 мг ткани, а затем 25 мкл коллагеназа II раствора фермента, 25 мкл раствора фермента гиалуронидазы и 250 мкл раствора хлорида кальция на 80 мг ткани. При работе с большим количеством ткани, шаги 2,4 - 2,9 может быть выполнена в культуре ткани T25 Колбы для удобства.
5. Инкубируйте в пожимая водяной бане установлена ​​на уровне 37 ° С в течение 20 минут. Удалить труб и растирают пипеткой для смешивания ферментов тщательно через ткани снова.
6. Заменить в водяной бане в течение еще 20 минут.
7. Сбор ткани с помощью центрифугирования при 400 мкг, в течение 8 минут. Удалите супернатант.
8. Ресуспендируют в 2 мл буфера для каждого 80 мг ткани, и повторить фермента и помимо хлорида кальция, что и выше. Инкубируйте 20 минут тряски в водяной бане. Удалить труб и растирают пипеткой для смешивания ферментов тщательно.
9. Инкубировать последние 20 минут тряски в водяной бане. Сбор клетки центрифугированием, как выше, отбросить супернатант.

3. Стиральная шаги

1. Ресуспендируют каждые 80 мг ткани в 2 мл буфера и пипетки для мытья ткани свободных ферментов.
2. Центрифуга, как ранее, чтобы собраться. Удалите супернатант.
3. Повторите мыть с использованием 1 мл буфера на 80 мг ткани. Центрифуга для сбора, отбросить супернатант.

4. Фильтрация

1. Ресуспендируют ткани раствор в 1 мл буфера на 80 мг ткани.
2. Добавить решение до 100 мкм пор по размерам фильтре, расположенном более чем в 50 мл трубки Falcon. Не применять более 3 мл рубленого решение ткани на колонке, а фильтры могут быть заблокированы. Разрешить просачиваться. Удалить фильтруется материал висит на нижней фильтра пипеткой, и добавить к фильтрату.
3. Используйте шприц с иглой 26 взять 50 мл фильтрата из труб и применяются до 50 мкм поры фильтров размером по 5 мл пробирок. Позвольте фильтр, помощь, ослабив крышками, если необходимо.
4. Пробирки центрифужные, как ранее, чтобы собраться. Удалите супернатант.

5. Покрытие и среднего

1. Смешайте все гранулы в одном томе. Граф с помощью автоматизированных счетчик ячейки или гемоцитометра.
2. Пластина клетки при плотности 0,4 х 10 ^{6 клеток} на лунку 12-луночного планшета, или 2,67 х 10 ^{6 клеток} на T25 колбу культуры ткани. Добавьте 1 мл MSG среду в каждую лунку или 6 мл на каждый T25 колбу.
3. Инкубировать при 37 ° C. Сферы, должны быть четко видимые днем ​​2.

6. Представитель Результаты:

Через два-три дня в области культуры, малые агрегаты клеток (salispheres) будет очевидным в культурах. Salispheres будет продолжать увеличиваться в размерах в течение десяти дней в культуре. Представитель микроскопии фазового контраста изображения salispheres показаны на рисунке 1. Пролиферирующих клеток, экспрессирующих стволовых клеток, белков, связанных с маркером может быть изолирована от этих сфер, оптимально 3-5 дней между сообщению изоляции, и способны к дифференцировке в функциональные, слюна ацинарных клеток.

Рисунок 1. Salisphere образование в пробирке. После механического и ферментативного пищеварения использовании настоящего протокола, сферы увеличением размера можно найти в плавучий культурами. Панели представитель фазового контраста изображения микроскопии сфер от нескольких дней 0 (), 4 (B), 7 (C) и 10 (D). Шкала бар = 50 мкм.

Обсуждение

Метод культуры тканей, описанные здесь представляет воспроизводимый протокол для выделения стволовых клеток, содержащих salispheres из слюнных желез мышей. Исследования с использованием клеток, выделенных таким образом выявили регенеративная способность слюнной железы стволовыми клетками ^9. Трансплантация сто с-Kit + клетки, полученные из индуцированных salispheres функционального восстановления облученных мышей слюнных желез. Эти данные являются захватывающими и обеспечить отправную точку для исследования стволовых клеток для терапии, основанной на сухость во рту. Многие пути еще предстоит исследовать однако, в том числе полного маркера экспрессии белка профиля стволовых клеток, способность подчелюстной желез, чтобы спасти функции облученных околоушной слюнной железы, и наоборот, и характеристика предполагаемых в естественных условиях стволовые клетки ниши клеток. В конечном счете, перевод этот протокол для образцов человеческой ткани и последующем потенциал для лечения ксеростомии в человеческом пациентов с использованием изолированных клеток является самым захватывающим применения описанного метода.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Store at – 20 °C
Collagenase II	GIBCO, by Life Technologies	17101-015	Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2	Sigma-Aldrich	E9644	Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2	Sigma-Aldrich	F0291	Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement	GIBCO, by Life Technologies	17502-048	As manufacturer instructions.
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers	BD Biosciences	352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size)	BD Biosciences	352235