Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Riepilogo

Un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule staminali dalla ghiandola salivare del mouse è descritto. Il metodo impiega digestione enzimatica e meccanica, e permette l'isolamento di salispheres contenenti cellule con caratteristiche di cellule staminali.

Abstract

Maturo ghiandole salivari di origine umana e topo comprendono un minimo di cinque tipi di cellule, ognuna delle quali facilita la produzione e l'escrezione di saliva nella cavità orale. Cellule acinari sierose e mucose sono le proteine ​​e mucose fabbriche della ghiandola, rispettivamente, e rappresentano l'origine della produzione di saliva. Una volta sintetizzate, le varie componenti enzimatiche e le altre proteica della saliva sono secreti attraverso una serie di cellule epiteliali duttali cuscinetto tipo morfologia, fino alla eventuale espulsione della saliva attraverso un condotto grande nella cavità della bocca. La composizione della saliva è anche modificata dalle cellule duttali durante questo processo.

Nella manifestazione di malattie come la sindrome di Sjögren, e in alcune situazioni cliniche come il trattamento di radioterapia per i tumori testa e collo, produzione di saliva da parte delle ghiandole è drasticamente ridotto ^1,2. La xerostomia risultante, una sensazione soggettiva di secchezza delle fauci, colpisce non solo la capacità del paziente di deglutire e parlare, ma incoraggia anche lo sviluppo della carie dentale e può essere socialmente debilitanti per il paziente.

Il restauro della produzione di saliva in condizioni cliniche di cui sopra rappresenta dunque un bisogno insoddisfatto clinico, e come tali diversi studi hanno dimostrato la capacità di rigenerazione delle ghiandole salivari ^3-5. Ulteriormente l'isolamento di cellule staminali simili a popolazioni di cellule provenienti da tessuti diversi all'interno del mouse e corpi umani ^6-8, abbiamo dimostrato con il metodo descritto che le cellule staminali isolate dalle ghiandole salivari del mouse può essere utilizzato per salvare la produzione di saliva in salivari irradiati ghiandole ^9,10. Questa scoperta apre la strada per lo sviluppo di cellule staminali a base di terapie per il trattamento di condizioni xerostomic negli esseri umani, e anche per l'esplorazione della ghiandola salivare come un microambiente che contengono cellule multipotenti con capacità auto-rigenerante.

Protocollo

1. Reggente di preparazione

1. Buffer: 1% (w / v) di BSA in soluzione salina bilanciata di Hank
2. Ricostituire enzimi. Enzima ialuronidasi: 40 mg / mL, sciolta in tampone. Collagenasi II: 23mg / ml, sciolta in tampone. Usa appena soluzioni enzima preparato fresco per ogni isolamento. Quando sciolto, conservare a 4 ° C fino all'utilizzo per la digestione.
3. 50 mM di cloruro di calcio in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterilizzare 0,2 uM dimensione dei pori.
4. Topo ghiandola salivare (MSG) terreno di coltura: DMEM: F12 con penicillina (100 UI / ml), streptomicina (100 mg / ml), glutamax (2 mm), fattore di crescita epidermico-2 (20 ng / mL), il fattore di crescita dei fibroblasti -2 (20 ng / mL), N2 supplemento (1%), l'insulina (10 mg / mL) e desametasone (1 mM).

2. Tissue Digestione meccanica e enzimatica

1. Pesare le ghiandole salivari sezionato.
2. Tritare ghiandole in una polpa omogenea utilizzando forbici sterili dissezione curve in un piccolo piatto di Petri.
3. Raccogliere tessuto tritata in 14 mL, utilizzando 1 ml di buffer per 80 mg di tessuto sottomandibolare. Lavare i piatti di Petri pulita di tessuto utilizzando alcuni buffer.
4. Aggiungere un altro 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto, seguito da 25 microlitri soluzione enzima collagenasi II, 25 microlitri soluzione enzimatica ialuronidasi e 250 microlitri di soluzione di cloruro di calcio per 80 mg di tessuto. Se si utilizzano grandi quantità di tessuto, a pochi passi 2,4-2,9 possono essere eseguite in tessuto fiasche T25 cultura per convenienza.
5. Incubare a bagnomaria agitazione a 37 ° C per 20 minuti. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente enzima attraverso il tessuto nuovo.
6. Sostituire a bagnomaria per 20 minuti.
7. Raccogliere i tessuti per centrifugazione a 400 xg, per 8 minuti. Gettare il surnatante.
8. Risospendere in 2 mL di tampone per ogni 80 mg di tessuto, e ripetere enzima e il cloruro di calcio aggiunta come sopra. Incubare 20 minuti in agitazione bagnomaria. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente gli enzimi.
9. Incubare per 20 minuti finali in agitazione bagnomaria. Raccogliere le cellule per centrifugazione come sopra, scartare il surnatante.

3. Fasi di lavaggio

1. Risospendere ogni 80 mg di tessuto in 2 mL di tampone e pipetta per lavare il tessuto privo di enzimi.
2. Centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante.
3. Ripetere il lavaggio con buffer di 1 ml per 80 mg di tessuto. Centrifuga per raccogliere, scartare il surnatante.

4. Filtraggio

1. Risospendere soluzione tessuto in 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto.
2. Aggiungi soluzione a 100 micron di dimensioni dei pori del filtro posto sopra tubo da 50 ml Falcon. Non applicare più di 3 ml di soluzione di tessuto macinato per colonna, i filtri possono essere bloccati. Permettono di filtrare attraverso. Rimuovere il materiale filtrato appeso inferiore del filtro con la pipetta, ed aggiungere al filtrato.
3. Usare siringa con 26 gauge a prendere filtrato dalla 50mL tubi e applicare i filtri a 50 micron dimensione dei pori, il 5 mL. Permettono di filtrare, assistendo allentando coperchi, se necessario.
4. Provette da centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante.

5. Placcatura e medie imprese

1. Combina tutti i pellets in un unico volume. Conte con contatore automatico di cellule o emocitometro.
2. Cellule germi a densità di 0,4 x 10 ⁶ cellule per pozzetto di 12 pozzetti, o 2,67 x 10 ⁶ cellule per T25 fiasco di coltura tissutale. Aggiungere 1 ml MSG medio in ciascun pozzetto o 6 ml per ogni pallone T25.
3. Incubare a 37 ° C. Sfere devono essere chiaramente visibili di giorno 2.

6. Rappresentante dei risultati:

Dopo due o tre giorni di cultura, piccoli aggregati di cellule (salispheres) sarà evidente nelle culture. Salispheres continuerà a crescere in dimensioni per un periodo di dieci giorni nella cultura. Rappresentante immagini microscopio a contrasto di fase di salispheres sono mostrati in Figura 1. Le cellule in proliferazione delle cellule staminali che esprimono proteine ​​associate marcatore può essere isolato da questi ambiti, in modo ottimale tra i giorni 3-5 isolamento post, e sono in grado di differenziazione in funzionali, le cellule acinari saliva produce.

Figura 1. Salisphere formazione in vitro. A seguito di digestione meccanica ed enzimatica utilizzando il protocollo attuale, sfere di dimensioni crescenti si possono trovare nelle culture galleggiante. I pannelli sono rappresentative immagini microscopio a contrasto di fase di sfere dai giorni 0 (A), 4 (B), 7 (C) e 10 (D). Barra di scala = 50 micron.

Discussione

Il metodo di coltura tissutale qui descritto rappresenta un protocollo riproducibile per l'isolamento di cellule staminali contenenti salispheres dalle ghiandole salivari di topi. Gli studi che utilizzano cellule isolate in questo modo hanno evidenziato la capacità rigenerativa delle cellule staminali della ghiandola salivare ^9. Il trapianto di un centinaio di c-Kit + cellule derivate dal salispheres indotto il recupero funzionale delle ghiandole salivari di topo irradiati. Questi dati sono entusiasmanti e di fornire un punto di partenza per lo studio della terapia con cellule staminali a base di xerostomia. Molte strade rimangono da esplorare però, compresa la piena profilo di espressione delle proteine ​​marker delle cellule staminali, la capacità delle ghiandole sottomandibolari per salvare la funzione delle ghiandole salivari, parotidi irradiati e viceversa, e la caratterizzazione dei putativi di nicchia delle cellule staminali in vivo di le cellule. In ultima analisi, la traduzione di questo protocollo di campioni di tessuto umano e il potenziale successive per la terapia di xerostomia nei pazienti umani con le cellule isolate è l'applicazione più interessante del metodo descritto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Store at – 20 °C
Collagenase II	GIBCO, by Life Technologies	17101-015	Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2	Sigma-Aldrich	E9644	Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2	Sigma-Aldrich	F0291	Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement	GIBCO, by Life Technologies	17502-048	As manufacturer instructions.
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers	BD Biosciences	352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size)	BD Biosciences	352235