Passaging אדם בתאי גזע עצביים

Summary

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.

Abstract

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מספק אמצעי לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות, כמו גם לחקור תהליכים בסיסיים רבים של ההתפתחות העצבית הפתולוגיה האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה של ​​culturing ו hNSPCs passaging בתקווה סטנדרטיזציה בטכניקה זו והגדלת reproducibility המחקר תא גזע אנושיים. HNSPCs אנו משתמשים נותקו מן cadaveric בקורטקס המוח לאחר הלידה על ידי משאב לאומי אנוש עצבית לתאי גזע גדל כמו תרבויות חסיד על צלוחיות מצופה פיברונקטין (פאלמר et al, 2001;.. שוורץ et al, 2003). אנחנו תרבות hNSPCs שלנו DMEM: F12 סרום ללא מדיה בתוספת EGF, FGF ו PDGF ומעבר להם 01:02 בערך כל שבעה ימים. שימוש בתנאים אלה, רוב התאים בתרבות לשמור על מורפולוגיה דו קוטבית להביע סמנים של מובחן בתאי גזע עצביים (כגון nestin ו Sox2).

Protocol

הערה: לקבלת culturing שגרתית של hNSPCs שלנו, אנו משנים 50-100% של התקשורת בכל יום אחר, ובדרך כלל מעבר להם 01:02 פעם בשבוע. תרבות התקשורת מכיל סיביות 9500 20%, 1X גורמים אנטיביוטי / antimycotic, וצמיחה (EGF, FGF, ואת כל PDGF ב 40 ng / ml) ב DMEM: F12 התקשורת הבסיס.

הכנת Flask מצופה dissociating תאים

1. כדי להכין צלוחיות חדש עבור התאים passaged, מעיל T25 צלוחיות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פיברונקטין האדם EMEM במשך 4 שעות או לילה, בתוך 37 ° C רקמות התרבות בחממה. ממש לפני passaging התאים, להסיר את הפתרון פיברונקטין ולשטוף את צלוחיות עם PBS.
2. מעבירים את הישן "מותנית" התקשורת מתאי להיות passaged את פיברונקטין מצופה צלוחיות חדשים (כגון כי במחצית נפח הסופי של המדיה עבור כל בקבוק יהיה "מותנה" התקשורת). אלה התנאים culturing לסייע לשמור על התאים האלה במצב מובחן שלהם.
3. לאחר שכל התקשורת היא להסיר את התאים להיות passaged, יש לשטוף את התאים פעם עם PBS. שימו לב שלא לייבש את התאים.
4. הוספת תא דיסוציאציה הצפת (CDB) ישירות על גבי התאים (1.0-1.5 מ"ל עבור בקבוק T25). דגירה תאים למאגר כ -5 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות את הבקבוק הקשה תסייע להאיץ את ניתוק התא.

Centrifuging, Resuspending, ותאי ציפוי

1. הוסף סרום המכיל מדיה (DMEM: F12 עם 10% חום מומת בסרום שור עוברי) (להשתמש ~ נפח 3X של CDB) כדי הבקבוק עם תאים מנותקת. הסר את המדיה התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש נפח קטן של סרום המכיל התקשורת טרי לשטוף את הבקבוק ולשחזר תאים שיורית.
2. צנטריפוגה התקשורת תאים ב 1000 סל"ד (~ 200xg) במשך 5 דקות.
3. יניקה מעל סרום המכיל מדיה resuspend התאים בתקשורת תרבות טריים, pipetting מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא הומוגנית.
4. העברת מחצית התאים resuspended לתוך בקבוק אחד חדש לפצל 01:02. שים לב למספר קטע חדש על הבקבוק.

Discussion

מצאנו כי פרוטוקול זה מספק אמין של תרבויות hNSPCs. גורם אחד קריטי עבור התאים שלנו היא שהם צריכים להיות כל הזמן כמו תרבויות צפוף למדי, ולא ניתן passaged עד כדי כך התאים דלילה. בידיים שלנו, תרבויות דליל לצמוח באיטיות רבה או לחלוטין הפסקת חלוקת. מסיבה זו, אנו בדרך כלל לפצל התרבויות שלנו 01:02 או...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	Peprotech	100-18B
PDGF-AB	Reagent	Peprotech	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016