Пассирования правам нервные стволовые клетки

Резюме

Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке позволяет исследовать их полезность в качестве клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также изучить человеческие развития нервной системы. Этот протокол представляет метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на повышение воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток.

Аннотация

Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке предоставляет средства для изучения их полезность как клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также для изучения многих фундаментальных процессов человеческого развития нервной системы и патологии. Этот протокол представляет собой простой метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на стандартизацию этой техники и повышения воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток. HNSPCs мы используем были изолированы от трупного послеродовой коры мозга, о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов и выросли как приверженец культур на колбы покрыты фибронектина (Palmer и др., 2001;.. Шварц и др., 2003). Мы культуре нашей hNSPCs в DMEM: F12, свободной от сыворотки среде с EGF, FGF и PDGF и прохождение их 1:02 примерно раз в семь дней. Используя эти условия, большинство клеток в культуре поддерживать морфологии биполярных и выражать маркеры недифференцированных нервные стволовые клетки (например, нестин и Sox2).

протокол

Примечание: Для рутинной культивирования наших hNSPCs, мы меняем 50-100% от средств массовой информации каждый день, и обычно их прохождения 1:02 раз в неделю. Медиакультуры содержит 20% BIT-9500, 1X антибиотик / противогрибковым, и факторы роста (EGF, FGF и PDGF каждый на 40 нг / мл) в DMEM: F12 СМИ базу.

Подготовка покрытием колбы и окончательно оторвать Клетки

1. Для подготовки новых контейнеров для пассировать клетки, пальто T25 колбы с 10 мкг / мл человеческого фибронектина в EMEM течение 4 часов, или на ночь, на 37 ° C культуре ткани инкубатора. Прямо перед пассирования клеток, фибронектина удалить раствором и промыть колбы с PBS.
2. Передача старой «условной» средств массовой информации из ячейки, которые будут пассировать на новый фибронектина покрытием колбы (например, что половина конечного объема средств массовой информации для каждой колбе будет «условной» СМИ). Эти условия культивирования помочь сохранить эти клетки в недифференцированное состояние.
3. Как только все средства массовой информации будет удален из ячейки, которые будут пассировать, промыть клетки сразу с PBS. Будьте осторожны, чтобы не иссякнуть клеток.
4. Добавить клеточной диссоциации буферов (CDB) непосредственно на клетки (1,0-1,5 мл на флакон T25). Инкубируйте клетки в буфере в течение 5 минут при комнатной температуре. Осторожно нажав колбу поможет ускорить ячейки отряда.

Центрифугирование, суспендирования и покрытие Клетки

1. Добавить сыворотке средах (DMEM: F12 с 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки) (использовать ~ 3X объема CDB) в колбу с отдельной клетки. Удалить СМИ и клеток к 15 мл коническую трубку. Использование небольшого объема свежей сыворотки средах для полоскания колбу и восстановления остаточных клеток.
2. Центрифуга СМИ и клеток при 1000 оборотов в минуту (~ 200xg) в течение 5 минут.
3. Всасывающая с сывороткой средах и ресуспендируйте клеток в свежей культуральной среды, пипетирования вверх и вниз, чтобы сделать однородной суспензии клеток.
4. Передача половины ресуспендировали клеток в каждом новом колбу на 1:02 раскол. Обратите внимание на новый номер прохода на колбу.

Обсуждение

Мы обнаружили, что этот протокол обеспечивает надежную культур hNSPCs. Одним из важнейших факторов для наших клеток является то, что они должны быть как достаточно плотная культуры и не может быть пассировать до того, что клетки являются редкими. В наших руках, редкие культуры растут очень медленно и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reagent	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016