Пассирования правам нервные стволовые клетки

Резюме

Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке позволяет исследовать их полезность в качестве клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также изучить человеческие развития нервной системы. Этот протокол представляет метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на повышение воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток.

Аннотация

Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке предоставляет средства для изучения их полезность как клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также для изучения многих фундаментальных процессов человеческого развития нервной системы и патологии. Этот протокол представляет собой простой метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на стандартизацию этой техники и повышения воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток. HNSPCs мы используем были изолированы от трупного послеродовой коры мозга, о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов и выросли как приверженец культур на колбы покрыты фибронектина (Palmer и др., 2001;.. Шварц и др., 2003). Мы культуре нашей hNSPCs в DMEM: F12, свободной от сыворотки среде с EGF, FGF и PDGF и прохождение их 1:02 примерно раз в семь дней. Используя эти условия, большинство клеток в культуре поддерживать морфологии биполярных и выражать маркеры недифференцированных нервные стволовые клетки (например, нестин и Sox2).

протокол

Примечание: Для рутинной культивирования наших hNSPCs, мы меняем 50-100% от средств массовой информации каждый день, и обычно их прохождения 1:02 раз в неделю. Медиакультуры содержит 20% BIT-9500, 1X антибиотик / противогрибковым, и факторы роста (EGF, FGF и PDGF каждый на 40 нг / мл) в DMEM: F12 СМИ базу.

Подготовка покрытием колбы и окончательно оторвать Клетки

1. Для подготовки новых контейнеров для пассировать клетки, пальто T25 колбы с 10 мкг / мл человеческого фибронектина в EMEM течение 4 часов, или на ночь, на 37 ° C культуре ткани инкубатора. Прямо перед пассирования клеток, фибронектина удалить раствором и промыт

Обсуждение

Мы обнаружили, что этот протокол обеспечивает надежную культур hNSPCs. Одним из важнейших факторов для наших клеток является то, что они должны быть как достаточно плотная культуры и не может быть пассировать до того, что клетки являются редкими. В наших руках, редкие культуры растут очень медленно и?...

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	Peprotech	100-18B
PDGF-AB	Reagent	Peprotech	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016