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Method Article
La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.
La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro fornisce un mezzo per indagare la loro utilità come i trapianti di cellule per scopi terapeutici e di esplorare molti processi fondamentali dello sviluppo umano neurale e patologia. Questo protocollo presenta un semplice metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di standardizzazione questa tecnica e aumentando la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali. Il hNSPCs che usiamo sono stati isolati da cadavere corteccia cerebrale postnatale dal National Human Resource cellule staminali neurali e cresciuto come culture aderente su fiaschi rivestiti con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Noi la nostra cultura hNSPCs in DMEM: F12 senza siero dei media integrato con EGF, FGF, PDGF e di passaggio e le 01:02 circa ogni sette giorni. Utilizzando queste condizioni, la maggior parte delle cellule in cultura mantenere una morfologia bipolare ed esprimono marker di cellule indifferenziate staminali neurali (come nestina e Sox2).
Nota: Per la coltura di routine dei nostri hNSPCs, cambiamo 50-100% dei media a giorni alterni e di solito li passaggio 01:02 una volta alla settimana. La cultura dei media contiene il 20% BIT-9500, 1X fattori antibiotica / antimicotica, e la crescita (EGF, FGF, PDGF e ciascuno a 40 ng / ml) in DMEM: F12 i media di base.
Preparazione del Flask patinate e Dissociare le celle
Centrifugazione, risospensione, e celle placcatura
Abbiamo scoperto che questo protocollo offre culture affidabile hNSPCs. Un fattore critico per le nostre cellule è che hanno bisogno di essere mantenuto il più culture piuttosto denso e non possono essere diversi passaggi al punto che le cellule sono scarse. Nelle nostre mani, le culture sparse crescono molto lentamente o cessare completamente divisione. Per questo motivo, siamo soliti suddividere le nostre culture 1:2 o 1:3 quando una cultura è estremamente denso. Rivestimento della superficie di un piatto cultura con fibronectina è im...
Gli autori ringraziano il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l'Ospedale dei Bambini, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di hNSPCs e l'istruzione iniziale nella loro coltura.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
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