Passaging cellule staminali neuronali

Riepilogo

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.

Abstract

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro fornisce un mezzo per indagare la loro utilità come i trapianti di cellule per scopi terapeutici e di esplorare molti processi fondamentali dello sviluppo umano neurale e patologia. Questo protocollo presenta un semplice metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di standardizzazione questa tecnica e aumentando la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali. Il hNSPCs che usiamo sono stati isolati da cadavere corteccia cerebrale postnatale dal National Human Resource cellule staminali neurali e cresciuto come culture aderente su fiaschi rivestiti con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Noi la nostra cultura hNSPCs in DMEM: F12 senza siero dei media integrato con EGF, FGF, PDGF e di passaggio e le 01:02 circa ogni sette giorni. Utilizzando queste condizioni, la maggior parte delle cellule in cultura mantenere una morfologia bipolare ed esprimono marker di cellule indifferenziate staminali neurali (come nestina e Sox2).

Protocollo

Nota: Per la coltura di routine dei nostri hNSPCs, cambiamo 50-100% dei media a giorni alterni e di solito li passaggio 01:02 una volta alla settimana. La cultura dei media contiene il 20% BIT-9500, 1X fattori antibiotica / antimicotica, e la crescita (EGF, FGF, PDGF e ciascuno a 40 ng / ml) in DMEM: F12 i media di base.

Preparazione del Flask patinate e Dissociare le celle

1. Per preparare nuovi palloni per le cellule diversi passaggi, cappotto fiasche T25 con 10 mg / ml fibronectina umana in Emem per 4 ore, o durante la notte, a 37 ° C di coltura tissutale incubatore. Poco prima passaging le cellule, rimuovere la soluzione fibronectina e risciacquare i palloni con PBS.
2. Trasferire il vecchio "condizionato" media dalle cellule da diversi passaggi per il nuovo fibronectina rivestite palloni (in modo tale che la metà del volume finale di media per ogni pallone sarà la "condizione" media). Queste condizioni di coltura contribuiscono a mantenere queste cellule nel loro stato indifferenziato.
3. Una volta che tutti i media viene rimosso dalle cellule di diversi passaggi, lavare le cellule una volta con PBS. Fare attenzione a secco non fuori le cellule.
4. Aggiungi cellulare dissociazione Buffer (CDB) direttamente sulle celle (1,0-1,5 ml per un pallone T25). Incubare le cellule nel buffer per circa 5 minuti a temperatura ambiente. Picchiettando delicatamente il pallone contribuirà ad accelerare il distacco delle cellule.

Centrifugazione, risospensione, e celle placcatura

1. Aggiungi siero contenenti media (DMEM: F12 con il 10% di siero siero fetale bovino) (usare ~ 3 volte il volume di CDB) al pallone con le cellule distaccata. Rimuovere il supporto e le cellule in una provetta da 15 ml. Utilizzare un piccolo volume di fresca siero contenente i media per sciacquare il pallone e recuperare le cellule residue.
2. Centrifugare i media e le celle a 1000 giri (~ 200xg) per 5 minuti.
3. Aspirazione fuori il siero contenenti media e risospendere le cellule in terreni di coltura fresco, pipettando su e giù per ottenere una sospensione omogenea cellulare.
4. Trasferire la metà delle cellule risospese in ogni pallone nuovo per una frazione di 1:2. Si noti il ​​nuovo numero passaggio sul pallone.

Discussione

Abbiamo scoperto che questo protocollo offre culture affidabile hNSPCs. Un fattore critico per le nostre cellule è che hanno bisogno di essere mantenuto il più culture piuttosto denso e non possono essere diversi passaggi al punto che le cellule sono scarse. Nelle nostre mani, le culture sparse crescono molto lentamente o cessare completamente divisione. Per questo motivo, siamo soliti suddividere le nostre culture 1:2 o 1:3 quando una cultura è estremamente denso. Rivestimento della superficie di un piatto cultura con fibronectina è im...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reagent	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016