Le repiquage des cellules souches humaines

Résumé

La capacité de manipuler humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs) in vitro permet d'étudier leur utilité comme les greffes de cellules à des fins thérapeutiques et d'explorer le développement humain de neurones. Ce protocole présente une méthode de culture et de hNSPCs repiquage dans l'espoir de reproductibilité croissante de la recherche des cellules souches humaines.

Résumé

La capacité de manipuler humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs) in vitro constitue un moyen d'étudier leur utilité comme les greffes de cellules à des fins thérapeutiques ainsi que d'explorer de nombreux processus fondamentaux du développement neuronal humain et la pathologie. Ce protocole présente une méthode simple de culture et de hNSPCs repiquage dans l'espoir de normaliser cette technique et en augmentant la reproductibilité de la recherche des cellules souches humaines. Le hNSPCs nous utilisons ont été isolés à partir de cadavres cortex cérébral post-natal par la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales et cultivés comme cultures adhérentes sur les flacons enduits de fibronectine (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nous la culture de notre hNSPCs dans un milieu DMEM: F12 milieu sans sérum complété par l'EGF, FGF et PDGF et le passage entre eux 01h02 environ tous les sept jours. En utilisant ces conditions, la majorité des cellules dans la culture de maintenir une morphologie bipolaire et expriment des marqueurs des cellules souches neurales indifférenciées (comme nestine et Sox2).

Protocole

Note: Pour la culture de routine de notre hNSPCs, nous changeons de 50-100% de la presse chaque jour d'autres et généralement leur passage 1h02 une fois par semaine. Les milieux de culture contient BIT-9500 à 20%, 1X facteurs antibiotiques / antimycotiques, et la croissance (EGF, FGF et PDGF chacun à 40 ng / ml) dans du DMEM: F12 média de base.

Préparer le flacon couché et dissocier les cellules

1. Pour préparer de nouveaux flacons pour les cellules repiquées, manteau flacons T25 avec 10 ug / ml de fibronectine humaine dans EMEM pendant 4 heures ou toute la nuit, dans un 37 ° C de culture de tissu incubateur. Juste avant repiquage des cellules, enlever la solution de fibronectine et rincer les flacons avec du PBS.
2. Transfert de l'ancien «conditionnée» des médias à partir des cellules d'être repiquées à la nouvelle fibronectine revêtement flacons (tels que la moitié du volume final de médias pour chaque ballon sera le «conditionnée» des médias). Ces conditions de culture aider à maintenir ces cellules dans leur état indifférencié.
3. Une fois que tous les médias est enlevé des cellules à être repiquées, rincer les cellules une fois avec du PBS. Prenez soin de ne pas sécher les cellules.
4. Ajouter dissociation cellulaire Tampon (CDB) directement sur les cellules (1,0-1,5 ml pour un flacon T25). Incuber les cellules dans le tampon pendant environ 5 minutes à température ambiante. Tapotant doucement le flacon permettra d'accélérer le détachement cellulaire.

Centrifugation, remise en suspension, et les cellules Placage

1. Ajouter sérum contenant des médias (DMEM: F12 avec 10% inactivé à la chaleur sérum de veau fœtal) (utiliser ~ 3X le volume de la CDB) dans le ballon avec des cellules individuelles. Retirez le papier et les cellules d'un tube de 15 ml conique. Utiliser un petit volume de sérum frais milieux contenant pour rincer le flacon et récupérer des cellules résiduelles.
2. Centrifuger les médias et les cellules à 1000 rpm (~ 200xg) pendant 5 minutes.
3. Aspirer les médias contenant du sérum et de remettre en suspension les cellules dans des milieux de culture frais, pipetage haut et bas pour faire une suspension cellulaire homogène.
4. Transfert de la moitié des cellules resuspendues dans chaque nouveau flacon pour une fraction de 01h02. Notez le numéro de nouveau passage sur le flacon.

Discussion

Nous avons trouvé que ce protocole fournit des cultures fiable de hNSPCs. Un facteur essentiel pour nos cellules est qu'elles doivent être maintenues en tant que cultures assez dense et ne peuvent pas être passées, au point que les cellules sont clairsemées. Dans nos mains, les cultures poussent très lentement clairsemées ou complètement cessent de se diviser. Pour cette raison, nous avons l'habitude diviser nos cultures 1:2 ou 1:3 quand une culture est extrêmement dense. Revêtement de la surface d'une boîte de cultur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reagent	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016