Passaging células-tronco neurais

Resumo

A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.

Resumo

A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro fornece um meio para investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos, bem como para explorar muitos processos fundamentais do desenvolvimento neural humana e patologia. Este protocolo apresenta um método simples de cultura e hNSPCs passaging na esperança de padronizar esta técnica e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa sobre células estaminais humanas. O hNSPCs usamos foram isolados a partir de cadáveres córtex cerebral pós-natal pela Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional e cresceu como adepto culturas em frascos revestidos com fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nós nossa cultura hNSPCs em DMEM: F12 sem soro meios suplementados com EGF, FGF, PDGF e passagem e eles 1:02 aproximadamente a cada sete dias. Utilizando essas condições, a maioria das células na cultura manter uma morfologia bipolar e expressam marcadores de células indiferenciadas as células-tronco neurais (como nestina e Sox2).

Protocolo

Nota: Para cultura de rotina do nosso hNSPCs, mudamos 50-100% dos meios de comunicação todos os dias e, geralmente, a passagem deles 01:02 uma vez por semana. A cultura da mídia contém BIT-9500 20%, 1X fatores antibiótico / antimicótico e crescimento (EGF, FGF, PDGF e cada um com 40 ng / ml) em DMEM: F12 media base.

Preparando o balão revestido e Dissociar as células

1. Para preparar novos frascos para as células várias passagens, casaco T25 frascos com 10 mg / ml fibronectina humana no EMEM por 4 horas, ou durante a noite, em um 37 ° C a cultura de tecidos incubadora. Direito antes passaging as células, remova a solução fibronectina e enxaguar os frascos com PBS.
2. Transferir o velho "condicionados" media a partir de células a ser várias passagens para o novo fibronectina revestido balões (de tal forma que metade do volume final de mídia para cada frasco será o "condicionada" de mídia). Estas condições de cultivo ajudar a manter essas células em seu estado indiferenciado.
3. Depois de todos os meios de comunicação é removida das células para ser várias passagens, lavar as células uma vez com PBS. Tome cuidado para não secar as células.
4. Adicionar celular dissociação Buffer (CDB) diretamente sobre as células (1,0-1,5 ml para um frasco T25). Incubar as células no buffer por cerca de 5 minutos à temperatura ambiente. Batendo o frasco vai ajudar a acelerar o desprendimento de células.

Centrifugação, ressuspensão e Células Plating

1. Adicionar soro contendo media (DMEM: F12 com 10% inativado pelo calor soro fetal bovino) (use ~ o volume de 3X CDB) para o frasco com as células destacadas. Remova a mídia e as células para um tubo de 15 ml. Use um pequeno volume de soro fresco contendo mídia para lavar o balão e recuperar as células residual.
2. Centrifugar a mídia e as células a 1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos.
3. Sucção fora da mídia contendo soro e ressuspender as células em meio de cultura fresco, pipetando para cima e para baixo para fazer uma suspensão celular homogênea.
4. Transferência de metade das células ressuspenso em cada frasco novo para um split 1:2. Anote o número de nova passagem sobre o frasco.

Discussão

Descobrimos que este protocolo proporciona culturas confiável de hNSPCs. Um fator crítico para as nossas células é que elas precisam ser mantidas como culturas bastante densa e não pode ser várias passagens a tal ponto que as células são esparsas. Em nossas mãos, culturas esparsas crescem muito lentamente ou deixam completamente de se dividir. Por essa razão, costumamos dividir nossas culturas 1:2 ou 1:3 quando uma cultura é extremamente densa. Superfície do revestimento de uma placa de cultura com fibronectina é importante, po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reagent	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016