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Method Article
A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.
A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro fornece um meio para investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos, bem como para explorar muitos processos fundamentais do desenvolvimento neural humana e patologia. Este protocolo apresenta um método simples de cultura e hNSPCs passaging na esperança de padronizar esta técnica e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa sobre células estaminais humanas. O hNSPCs usamos foram isolados a partir de cadáveres córtex cerebral pós-natal pela Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional e cresceu como adepto culturas em frascos revestidos com fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nós nossa cultura hNSPCs em DMEM: F12 sem soro meios suplementados com EGF, FGF, PDGF e passagem e eles 1:02 aproximadamente a cada sete dias. Utilizando essas condições, a maioria das células na cultura manter uma morfologia bipolar e expressam marcadores de células indiferenciadas as células-tronco neurais (como nestina e Sox2).
Nota: Para cultura de rotina do nosso hNSPCs, mudamos 50-100% dos meios de comunicação todos os dias e, geralmente, a passagem deles 01:02 uma vez por semana. A cultura da mídia contém BIT-9500 20%, 1X fatores antibiótico / antimicótico e crescimento (EGF, FGF, PDGF e cada um com 40 ng / ml) em DMEM: F12 media base.
Preparando o balão revestido e Dissociar as células
Centrifugação, ressuspensão e Células Plating
Descobrimos que este protocolo proporciona culturas confiável de hNSPCs. Um fator crítico para as nossas células é que elas precisam ser mantidas como culturas bastante densa e não pode ser várias passagens a tal ponto que as células são esparsas. Em nossas mãos, culturas esparsas crescem muito lentamente ou deixam completamente de se dividir. Por essa razão, costumamos dividir nossas culturas 1:2 ou 1:3 quando uma cultura é extremamente densa. Superfície do revestimento de uma placa de cultura com fibronectina é importante, po...
Os autores agradecem o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de hNSPCs e instrução inicial em sua cultura.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
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