인간 신경 줄기 세포를 Passaging

요약

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사하고 인간의 신경 발달을 탐험하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간의 줄기 세포 연구의 증가 재현성의 희망에 culturing 및 passaging hNSPCs의 방법을 보여줍니다.

초록

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사할뿐만 아니라 인간의 신경 발달과 병리 많은 근본적인 과정을 탐구하는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은이 기술을 표준화하고 인간의 줄기 세포 연구의 재현성을 증가 기대에 culturing 및 passaging hNSPCs의 간단한 방법을 제공합니다. 우리가 사용하는 hNSPCs은 국립 인간 신경 줄기 세포 자원에 의해 시체 같은 출생 후의 두뇌 cortices으로부터 격리 및 flasks에 점착 성의 문화가 fibronectin (팔머 외, 2001..; 슈워츠 외, 2003)와 코팅으로 성장했다. DMEM에 우리 문화는 우리 hNSPCs : F12 혈청이없는 미디어 EGF, FGF 및 PDGF와 함께 보충 및 통로들을 1시 2분 약 매 칠일. 이러한 조건을 사용하여 문화의 세포의 대부분은 바이폴라 형태를 유지하고 undifferentiated 신경 줄기 세포 (예 : nestin 및 sox2 등)의 마커를 표현한다.

프로토콜

참고 : 일주일에 한번씩 우리 hNSPCs의 일상 culturing 들어, 우리가 매일하고 일반적으로 통로를 1시 2분 미디어 50-100%을 변경합니다. F12 기지 미디어 : 문화 미디어는 20 %의 비트 9500 DMEM에 1X 항생제 / antimycotic 및 성장 요인을 (EGF, FGF 및 PDGF 40 NG / ML 각)이 포함되어 있습니다.

코팅 휴대용 술병을 준비하고 세포를 Dissociating

1. 37 10 μg / 야간 4 시간 또는 EMEM에 ML 인간 fibronectin과 passaged 세포, 코트 T25 flasks, ° C 조직 문화의 인큐베이터에 대한 새로운 flasks를 준비합니다. 오른쪽 세포를 passaging 전에 fibronectin 솔루션을 제거하고 PBS로 flasks을 씻어.
2. 새로운 fibronectin - 코팅 flasks (각 플라스크에 대한 미디어의 절반 최종 볼륨이 "시설"미디어된다는 등)에 passaged 수 세포에서 오래된 "시설"미디어를 전송합니다. 이러한 culturing 조건들은 undifferentiated 상태에서 이러한 세포를 유지 도움이됩니다.
3. 일단 미디어의 모든 passaged 수 세포에서 제거, PBS로 한번 세포를 씻어. 세포를 건조하지 않도록 조심 해요.
4. 직접 세포 (T25 플라스크에 대한 1.0-1.5 ML)에 셀 분리 버퍼 (CDB)를 추가합니다. 실온에서 약 5 분 동안 버퍼에 세포를 품어. 부드럽게 휴대용 술병을 감청하는 것은 세포 분리 속도를 도움이 될 것입니다.

, Centrifuging Resuspending 및 도금 세포

1. 분리된 세포와 술병을 (CDB의 ~ 3 배 볼륨을 사용) : 혈청 함유 미디어 (F12 10 %로 열 inactivated 태아 소 혈청 DMEM)을 추가합니다. 15 ML 원뿔 관에 미디어 및 세포를 제거합니다. 플라스크를 씻어 잔류 세포를 복구하는 신선한 혈청 함유 미디어의 작은 볼륨을 사용합니다.
2. 5 분 1,000 RPM (~ 200xg)에서 미디어 및 세포를 원심 분리기.
3. 혈청 함유 미디어에서 흡입 및 단일 세포 현탁액을하고 위아래로 pipetting, 신선한 문화 매체에있는 세포를 resuspend.
4. 1시 2분 분할에 대한 새로운 각 플라스크에 resuspended 세포의 절반을 전송합니다. 플라스크에있는 새로운 통로 번호를 적어 둡니다.

토론

우리는이 프로토콜 hNSPCs의 신뢰할 수있는 문화를 제공하는 것으로 나타났습니다. 우리의 세포에 대한 하나의 중요한 요소들은 상당히 밀도 문화로 보관하고 세포가 스파스되는 시점 passaged 수 없습니다 필요합니다. 우리 손에, 스파스 문화는 매우 느리게 성장 또는 완전히 분열 중지. 문화가 매우 밀도 때 이러한 이유로, 우리는 보통 우리 문화 1시 2분 또는 1시 3분 분할. 그것이 좋은 세포 부착 및 마이 그 레이션...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reagent	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016