זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Summary

פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הועסק לזהות תחמוצת החנקן מתאי אנדותל העורקים שור ו אניון קיצוני superoxide של נויטרופילים האדם באמצעות ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) ₂ ו - 5,5-דימתיל-1-pyroroline-N-אוקסיד, DMPO, בהתאמה.

Abstract

חנקן מגיב / מינים חמצן (ROS / RNS) בריכוזים נמוכים יש תפקיד חשוב בוויסות תפקוד התא, איתות, ואת התגובה החיסונית, אך בריכוזים לא מוסדרים ופוגעים כדאיות התא ^{1, 2.} בעוד מערכות החיים התפתחו עם מנגנוני ההגנה אנדוגני נוגדי חמצון תזונתיים להסדרת ROS דור, ROS מיוצרים ללא הרף טבעי תוצרי לוואי של חילוף החומרים הנורמלי של חמצן יכול לגרום נזק חמצוני ביומולקולות וכתוצאה מכך אובדן תפקוד החלבון, מחשוף ה-DNA, או שומנים בדם peroxidation ^3, ובסופו של דבר סטרס חמצוני שמוביל לפציעה או מוות התא ^4.

אניון קיצוני superoxide (O ₂ • -) הוא המבשר העיקרי של כמה מינים ביותר ביותר חמצון הידועים קיימות במערכות ביולוגיות כגון peroxynitrite ו הידרוקסיל הרדיקלי. דור של O ₂ • - מסמל הסימן הראשון של פרץ חמצוני, ולכן, אניTS ו איתור / או התפיסה במערכות ביולוגיות חשוב. בהפגנה זו, O ₂ • - נוצר מ נויטרופילים polymorphonuclear (PMNs). באמצעות גירוי chemotactic עם phorbol-12-myristate אצטט-13 (PMA), PMN מייצר O ₂ • - באמצעות הפעלת nicotinamide אדנין מונואמין פוספט (NADPH) dinucleotide ^5.

תחמוצת החנקן (NO) synthase אשר מגיע בשלושה isoforms, כמו מושרה-, עצבי ו-האנדותל-NOS, או אינוס, nNOS או אינס, בהתאמה, מזרז את ההמרה של L-ארגינין ל L-Citrulline, באמצעות NADPH לייצר NO ⁶ . הנה, אנחנו שנוצר NO מתאי אנדותל. בתנאי סטרס חמצוני, אינס למשל יכול לעבור מייצור אין O ₂ • - בתהליך הנקרא שיחררה את סוגר, אשר ככל הנראה נגרם על ידי חמצון של heme ⁷ או שיתוף גורם, tetrahydrobiopterin (BH ₄₎ ^8.

יש רק מעטיםשיטות אמינות לגילוי של רדיקלים חופשיים במערכות ביולוגיות, אלא מוגבלים על ידי סגוליות ורגישות. השמנה ספין משמש בדרך כלל לצורך זיהוי של רדיקלים חופשיים כרוך התגובה תוספת של קיצוני במלכודת הספין ויוצרים adduct ספין מתמשך, אשר ניתן לאתרם באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה אלקטרונים (EPR) פאראמגנטיים. את adducts קיצוניים שונים מציגים מגוון ייחודי אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים והוא יכול לספק מידע רב על הטבע ועל קינטיקה של ייצור רדיקלי ^9.

Nitrones את מוט ההיגוי, 5,5-דימתיל-pyrroline-N-אוקסיד, DMPO ^10, DEPMPO phosphoryl-להחליף ^11, אסתר, להחליף, EMPO ¹² ו BMPO ^13, היה בשימוש זמן רב כמו מלכודות ספין - הספין האחרון מלכודות להציג עוד מחצית חיים של O ₂ • - adduct. ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) _{2 <}/> תת הוא נפוץ ללכוד NO בשל שיעור גבוה של היווצרות adduct ויציבות גבוהה של adduct ספין ^14.

Protocol

1. התרבות של תאים אבי העורקים שור אנדותל (BAEC)

1. טכניקות אספטיים ראויים היו במעקב.
2. ב בינוני אמבטיה, מים חמים ללא אנטיביוטיקה ב 37 ° C.

הערה: בינוני מורכב בינוני פנול חינם שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) עם 4.5 גלוקוז-D גר '/ ל', 4 מ"מ L-גלוטמין, 1% לא חיוניות חומצות אמינו, בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו - 2.5 מ"ג / ל 'צמיחה האנדותל גורם.

3. הסר את T75 תאים בקבוק שהכיל מן החממה ולנקות את פני השטח של הבקבוק עם אתנול 70% לפני הצבתו בתוך מכסה המנוע.
4. הסר את המדיום הישן באמצעות aspirator ולשטוף פעמיים עם 5 מ"ל של חיץ פוספט Dulbecco של מי מלח (DPBS).
5. הוסף 2 מ"ל של טריפסין ולחכות 4-5 דקות עבור תאים לנתק תוך מעת לעת לבדוק תחת מיקרוסקופ.
6. הוסף 3 מ"ל של מדיום שוב ושוב מערבבים בעזרת פיפטה כדי לא נפרדהוא התאים וליצור אפילו השעיה.
7. העברת 5 מ"ל של מדיום עם טריפסין לצינור 15 מ"ל ו - 121 גרם צנטריפוגות ב 5 דקות.
8. הסר את supernatant באמצעות aspirator. הוסף 5 מ"ל של DPBS ומערבבים היטב. סרכזת ב 121g במשך 5 דקות.
9. Aspirate supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ידי הוספת 6 מ"ל של המדיום.
10. על צלחת 6-היטב, להוסיף 1 מ"ל של תרחיף תאים זה טוב ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של המדיום. מערבבים את ההשעיה באמצעות פיפטה.
11. לתייג את הצלחת דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

2 א. זיהוי של NO עם תא BAEC

1. טכניקות אספטיים ראויים היו במעקב.
2. הסר את צלחת 6-היטב החממה ואת לשאוב מבאר בינוני 1. שוטפים את התאים פעמיים עם 1 DPBS מ"ל.
3. הוסף μl 210 של 1.9 mM heptahydrate ברזל סולפט (ב) ₍₄ FeSO 0.7 H ₂ O, להכין טרי על ידי המסת 0.8 מ"ג1 DPBS מ"ל עם CaCl ₂ ו MgCl ₂₎ ו 210 μl של N-methyl-D-glucamine אמוניום dithiocarbamate (MGD, להכין טרי על ידי המסת 2.7 מ"ג ב -500 DPBS μl עם CaCl ₂ ו MgCl ₂₎ באמצעות יחס של 1:07 . (הערה:. זה היחס שבו MGD עודף משמש הועסק כמקובל להכנת Fe ^{2 +-MGD} מורכבת בשל העובדה כי התשואה עבור Fe ^{3 +-MGD} מוגדל בנוכחות MGD עודף תוספת של ascorbate בפתרון לייצב את Fe ^{2 +-MGD} אין צורך מאז ³ NO-Fe ^+-MGD נוצר מצטמצם endogenously כדי להבחין EPR NO-Fe ^{2 +-MGD} ידי ascorbate, הידרוקינון, או ציסטאין עם יעילות המרה של עד ל 99.9% .. ספין נמוך diamagnetic מדינת Fe ^{2 +} מאפשר איתור של NO באמצעות תאים שטוח או צינור נימי ללא צורך במכשיר בטמפרטורה נמוכה) ^15.
4. מערבולת ההשעיה וכתוצאה מכך גם ולהוסיף 4.6 μאני ionophore של סידן (Cai) (מוכן מפתרון מלאי של mM 1.9 ידי המסת 1 מ"ג 1 מ"ל DMSO).
5. הפתרון מערבולת שוב דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות על מנת להמשיך לאפשר הפחתה של NO-Fe ^{3 +-MGD} כדי להבחין EPR NO-Fe ^{2 +-MGD.}
6. איסוף supernatant (425 μl) בצינור Eppendorf והעברת לתא EPR שטוח (או צינור נימי 50 μl).
7. פרמטרים EPR הרכישה הם: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3427 G, אפנון אמפליטודה: 6.0 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 1 x 10 ^5: כוח מיקרוגל: 10 mW, המספר הכולל של סריקות: 121; זמן סריקה: 10 שניות, וזמן קבוע: 20 ms (הערה: מאז פרמטרים משתנים ממכשיר אחד למשנהו תנאי הניסוי, אם כן, רק את מרכז המגרש, תדירות אפנון משרעת הם הפרמטרים החשובים ביותר שיש להביא בחשבון.).
8. רשום את ספקטרום בטמפרטורת החדר ספקטרה 2-D היו integדורג להפחית את רעשי הרקע ואת הבסיס לתקן באמצעות Bruker WinEPR תוכנת עיבוד נתונים או תוכנה אחר לעיבוד נתונים. על כימות של היווצרות adduct, מגרשים סטנדרטיים של ריכוז העוצמה מול אות (או אזור) ניתן לבנות באמצעות SNAP NO התורם.

2B. אינס ניסוי שיחררה את סוגר

1. הסר את צלחת 6-היטב החממה ואת לשאוב מבאר בינוני 2 ולשטוף פעמיים עם 1 DPBS מ"ל.
2. התורם peroxynitrite, 5-אמינו-3-(4-morpholinyl) -1,2,3-oxadiazolium כלוריד (SIN-1) שימש ניתקת אינס ^16. הוסף 100 μl של 0.5 מ"מ Sin-1 _(M-R 206.6 g / mol, מפתרון 10 mM המניות מוכן טרי על ידי המסת 1 מ"ג SIN-1 ב 500 μl של PBS עם יוני אין CA / מ"ג) כדי לדלל 2 מ"ל עם DPBS ו 10% FBS.
3. דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
4. הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף פעמיים עם DPBS.
5. הוסף μl 210 של2.8 מ"מ FeSO ₄ 0.7 H ₂ O ו - μl 210 מ"מ 19.6 MGD מוכן טרי על פי הנוהל הנ"ל.
6. הפתרון לערבל ומוסיפים 4.6 μl של צאי mM 1.9.
7. הפתרון מערבולת שוב דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות.
8. איסוף supernatant (425 μl) בצינור Eppendorf והעברת לתא שטוח EPR.
9. פרמטרים EPR הרכישה הם: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3427 G, אפנון משרעת: 6 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 1 x 10 ^5: כוח מיקרוגל: 10 mW, המספר הכולל של סריקות: 121; זמן סריקה: 10 שניות, וזמן קבוע: ms 20.
10. רשום את ספקטרום ו ספקטרה 2-D שולבו כדי להפחית את רעשי הרקע ואת הבסיס לתקן כאמור לעיל.

3. זיהוי של O ₂ • - מ נויטרופילים Polymorphonuclear (PMNs)

1. נויטרופילים בודדו דגימת דם האדם כפי שתואר קודם לכן ¹⁷.
2. להפוך את פתרון מלאי של 1 M DMPO * ב PBS המכיל 0.1 מ"מ diethylenetriamine-pentaacetic חומצה (DTPA). DMPO יש נקודת התכה של 25-29 מעלות צלזיוס כל כך נוח יותר פיפטה DMPO נוזלי (~ 1.02 גרם / מ"ל צפיפות של 25 מעלות צלזיוס) כדי בקבוקון זכוכית (הערה: אין להשתמש צלוחיות פלסטיק במשקל מאז DMPO טהור מגיב עם פלסטיק). קפוא DMPO ניתן נמס על ידי מים זורמים פושר על הבקבוקון (הערה: לא להפעיל את המים החמים כמו DMPO עלול להתפרק).
3. חשוב להשתמש טוהר DMPO גבוהה (> 99%) מאז כמה מלכודות ספין זמינים מסחרית מכילים זיהומים פאראמגנטיים, ועל כן, חובה להפעיל מגוון EPR של פתרון פשוט DMPO בלבד (10 מ"מ במקרה זה). זה קריטי, כי אין אות הרקע ניכר (ראה איור 3 א).
4. הכן פתרון המניות (1 מ"ג / מ"ל) של phorbol-12-myristate אצטט-13 (PMA) ב DMSO. הפוך את aliquots ידי דילול הפתרון מיקרוגרם 10 / מ"ל ​​ב PBS.
5. ב 1.5 מ"ל צינור Eppendorf, להכין את הפתרון עם נפח כולל של 0.6 מ"ל על ידי ביצוע רצף בנוסף: ~~~HEAD=NNS 10 ⁶ תאים לכל מ"ל של PMN, D-גלוקוז (1 מ"ג / מ"ל) ואלבומין (1 מ"ג / מ"ל), 10 DMPO mM ו 0.2 מיקרוגרם / מ"ל של PMA. (הערה: PMA הוא activator הרדיקלי יש להוסיף אחרון).
6. מעבירים את הפתרון לתא שטוח EPR.
7. EPR רכישה תנאי פרמטרים: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3486 G, אפנון אמפליטודה: 0.5 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 5 X 10 ^5, המספר הכולל של סריקות: 10, זמן סריקה: 30 שניות ; כוח מיקרוגל: 20 mW, וזמן קבוע: ms 81. על כימות של היווצרות adduct, מגרשים סטנדרטיים של ריכוז העוצמה מול אות (או אזור) ניתן לבנות באמצעות nitroxides יציבים כגון קצב או 3-carboxylic חומצה PROXYL.

* הערה חשובה על השימוש DMPO: באמצעות תא שטוחה, ניתן להגדיל את צפיפות התאים ועל ידי כך להגדיל את האותעוצמת adduct ספין אבל מחצית חיים של O ₂ • - adduct של DMPO קצר (t _1/2 ~ 1 דק '), אשר מתפרק כדי DMPO-OH. DMPO ניתן להחליף באמצעות ריכוזים של אותו EMPO, BMPO או DEPMPO אשר זמינים מסחרית ליציבות adduct מוגברת עם T _1/2 ~ 8 ו - 14 דקות, בהתאמה.

4. נציג תוצאות

ספין לכידה של NO הרדיקלי בוצעה באמצעות Fe ^{2 +-MGD.} איור 2a ו-2b להראות שום סימן EPR מ Fe ^{2 +-MGD} או תערובת של Fe ^{2 +-MGD} עם קאי, המציין כי אין אות NO רקע מקורו ריאגנטים אלה. BAEC על גירוי עם צאי משחרר NO אשר מגיב עם Fe ^{2 +-MGD} ליצירת adduct ספין, NO-Fe ^{2 +-MGD,} ומראה אות שלישיה אופיינית עם פיצול הערך hyperfine (hfsc) קבוע של 12.66 = _N ו - G G-גורם של G = 2.040. (איור 2 ג). HFערך SC נקבע באמצעות תוכנת סימולציה WINSIM שניתן להורדה באתר NIEHS EPR מסד נתונים תוכנה. Hfsc הניסוי עולה בקנה אחד עם הערך בספרות של _N = 12.70 G ו-G = 2.041 ¹⁸ עבור NO-Fe ^{2 +-MGD} adduct. כמו כן, ההשפעה של SIN-1 על BAEC הוריד את ייצור NO בשל אינס קשירה והתרה כפי שמוצג באיור 2 ד.

מלכודת DMPO ספין שימש O ₂ • - זיהוי. DMPO לבד לא נתן אות כפי שמוצג באיור 3 א המאשרת כי במלכודת הספין הוא ללא זיהומים פאראמגנטיים. איור 3 ב הוא הספקטרום של DMPO ו PMNs בלבד, כמו כן, אין כל סימן לזיהוי המצביע על כך DMPO אינו גורם הפעלת האנזים NADPH אוקסידאז. איור 3 ג מראה את האות EPR שנצפה על ידי גירוי של PMN PMA. הערכים hfsc לאות זה נקבעו להיות _N = 14.71 G, A _&בטא;-H = 11.40 G _{​​ו-H γ} = 1.25 G, עולים בקנה אחד עם ערכי הספרות של _N = 14.3 G, _β-H = 11.7 G _{ו-H γ} = 1.3 גרם ¹⁹ עבור DMPO-O ₂ H adduct.

באיור 1. תרשים זרימה לצורך זיהוי של רדיקלים של נויטרופילים BAEC באמצעות השמנה ספין EPR. (א) PMNs היו מעורבים עם DMPO ו PMA, ואת התערובת וכתוצאה מכך הועבר לתא שטוח EPR לרכישת נתונים. (ב) BAEC גדלו על צלחת, ושטפה עם DPBS. מלכודת ספין פה (MGD) ₂ נוספה יחד עם קאי. הפתרון היה מעורב באופן יסודי מודגרות. תערובת הועבר לתא שטוח EPR לרכישת נתונים EPR.

2. איור EPR זיהוי של NO מ-BAEC. (א) ספקטרום של Fe ^{2 +-MGD} רק (ב) ספקטרום של Fe ^{2 +} +-MGD צאי בלבד. (ג) קשת שלישיה כתוצאה השמנה NO על ידי Fe ^{2 +-MGD} באמצעות צאי, גירוי התאים. (ד) ספקטרום מראה ירידה בייצור NO בשל 0.5 מ"מ SIN-1 טיפול של תאים.

3. איור EPR זיהוי של DMPO-O ₂ H מ נויטרופילים הופעלו. (א) ספקטרום של DMPO 10 מ"מ בלבד. (ב) ספקטרום של PMN לבד בנוכחות DMPO 10 מ"מ. (ג) ספקטרום של PMN מופעל על ידי PMA בנוכחות DMPO 10 מ"מ.

Discussion

השמנה EPR ספין כבר המועסקים במגוון רחב של יישומים ביו לכימות וזיהוי רדיקלים חופשיים. השמנה ספין הוא רגיש במיוחד, מסוגל לאתר רדיקלים בריכוזים הנעים בין ננומטר ל מיקרומטר ובכך מתאים ליישום במערכות ביולוגיות. היווצרות adduct פאראמגנטיים, NO-Fe ^{2 +-MGD,} הוא הבסיס של זיהוי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (לא חובה)
פנול בינוני ללא DMEM גלוקוז גבוה 1X	GIBCO	31053
0.25% טריפסין-EDTA	GIBCO	25200
L-גלוטמין	פישר סיינטיפיק	BP379-100
ממ ללא חומצות האמינו החיוניות	GIBCO	11140
בסרום שור עוברית	אטלנטה ביולוגיות	S11550
צמיחה האנדותל גורם	Millipore	02-102
צאי	אנזו מדעי החיים	A-23187	להמיס DMSO
SIN-1	אנזו מדעי החיים	BML-CN245-0020
DMPO	Dojindo מעבדות	D048-10
FeSO 4 0.7 H 2 O	סיגמא אולדריץ'	215422-250 גרם	להמיס PBS עם Ca ו Mg
MGD	אנזו מדעי החיים	ALX-400-014-M050	להמיס PBS עם Ca 2 + ו - Mg 2 +
BAEC תאים	מערכות תא	2B2-C75
DMSO	פישר סיינטיפיק	BP231-100
DPBS	סיגמא אולדריץ'	D8537
DPBS עם CaCl 2 ו MgCl 2	סיגמאldrich	D8662
Phorbol-myristate אצטט (PMA)	סיגמא אולדריץ'	79346-במינון של 1