一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

要約

電子常磁性共鳴（EPR）分光法はウシ大動脈内皮細胞および鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオ、Feを（MGD）を用いてヒト好中球からのスーパーオキシドラジカルアニオンから一酸化窒素を検出するために採用した ₂と、それぞれ5,5 - ジメチル-1 - pyroroline-N-オキシド、DMPO、。

要約

低濃度で反応性窒素/酸素種（ROS / RNS）は、シグナル伝達、細胞機能の調節に重要な役割を果たしていると、免疫応答が無秩序な濃度で細胞生存率を^1、2に有害である。生きているシステムでは、ROSの生成を調節する内因性および栄養抗酸化防御機構と進化してきた一方で、ROSは、酸素の正常な代謝の副産物自然に連続的に製造されており、タンパク質の機能の喪失、DNAの切断、または脂質に生じる生体分子への酸化的損傷を引き起こす可能性があります過^3、最終的に細胞傷害または死亡を⁴につながる酸化ストレスに。

スーパーオキシドアニオンラジカル（O _2• - ）は、ペルオキシナイトライトとヒドロキシルラジカルのような生物学的システムに存在することが知られている最も高度な酸化種のいくつかの主要な前駆体である。 O ₂の生成• -私は、したがって、酸化的バーストの最初の兆候を通知し、TSの検出および/または生物学的システムの隔離が重要である。このデモでは、O _2• -多形核好中球（多形核白血球）から生成されました。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）オキシダーゼ⁵の活性化を介して-ホルボール-12 -ミリステート-13 -アセテート（PMA）と走化性刺激により、PMN。•O _2を生成_します 。

3つのアイソフォームで提供一酸化窒素（NO）合成酵素は、誘導-、神経と血管内皮-NOS、またはiNOSの、nNOSのか、eNOSのは、それぞれ、番号^6を生成^しないようにNADPHを用いて、L-シトルリンにL-アルギニンの変換を触媒として。ここでは、内皮細胞からNOを生成しません。酸化的ストレス条件下で、例えばeNOSのは•O _2、NOを生産に切り替えることができます-ヘム⁷または補助因子の酸化によって引き起こされると考えられている脱共役と呼ばれるプロセスで、テトラヒドロビオプテリン（BH _^4）8。

少数がありますしかし、生体系におけるフリーラジカルの検出のための信頼できる方法は特異性と感度によって制限されます。スピントラッピングは、一般的にフリーラジカルの同定に使用され、電子常磁性共鳴（EPR）分光法によって検出することができる永続的なスピン付加物を形成するスピントラップへのラジカルの付加反応を伴うされています。様々なラジカル付加物は、生成されるラジカルを識別し、ラジカルの産生⁹の性質と動態に関する豊富な情報を提供することができます使用することができる独特のスペクトルを示す。

環状ニトロン、5,5 -ジメチル-ピロリン-N-オキシド、DMPO ^10、ホスホリル置換されDEPMPO ^11、エステル置換EMPO ¹² BMPO ^13は 、広くスピントラップとして採用されている-後者のスピン付加-トラップは、O _2•のために長い半減期を示す。鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオカルバミン酸の_{Fe（MGD）2 <}/ SUB>は、一般的に付加体形成とスピン付加物¹⁴の高安定度の高い率のためにNOを捕捉するために使用されていません。

プロトコル

1。ウシ大動脈内皮細胞（BAEC）の培養

1. 適切な無菌テクニックが続いていた。
2. 37抗生物質なしで水浴、暖かい培地℃で

注：培地は4.5 g / LのD-グルコースとフェノールフリーダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で構成されており、10％ウシ胎児血清（FBS）および2.5を添加した4 mM L-グルタミン、1％非必須アミノ酸、 mg / Lの内皮細胞増殖因子。

3. インキュベーターからT75フラスコを含むセルを削除し、フードの内側に配置する前に、70％エタノールでフラスコの表面を清掃してください。
4. アスピレーターを使用して、古い培地を除去し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の5 mlで2回洗浄する。
5. トリプシンの2ミリリットルを追加し、定期的に顕微鏡下で検査しながら切断する細胞4-5分間待ちます。
6. 培地3mlを追加して、繰り返して、別のtにピペットを用いて混在させる彼は細胞とも懸濁液を作成します。
7. 5分間121グラムで15 mlのチューブと遠心分離機にトリプシンで培地5mlを転送します。
8. アスピレーターを用いて上清を取り除きます。 DPBS 5mlを加え、よく混ぜます。 5分間121グラムで遠心します。
9. 上清を吸引除去し、培地6mlを加えることによって細胞ペレットを再懸濁する。
10. 6ウェルプレートに、ウェルを培地1mlを追加するたびに細胞懸濁液1 mlを加える。ピペットを用いて懸濁液を混ぜる。
11. ラベルプレートと37℃、5％CO _2を一晩インキュベートする。

2A。 BAEC細胞とNOの検出

1. 適切な無菌テクニックが続いていた。
2. インキュベーターから6ウェルプレートを取り外し、最初のウェルから培地を吸引除去する。 1 mlのDPBSで細胞を2回洗浄します。
3. 1.9 mMの硫酸鉄（II）七水和物（のFeSO _{4·7H 2} O、で0.8 mgを溶解することによって新たに準備する210μlを加え1 mlのCaCl ₂とMgCl _2を持つDPBS）とアンモニウム210μlの午前1時07分の比を用いてN-メチル-D-グルカミンジチオカルバメート（MGD、CaCl ₂とMgCl _2を 500μlのDPBSで2.7 mgを溶解することにより、新たに調製） （注：過剰MGDが使用されているこの比率は、従来のFe ³の収率は^+-MGDを過剰MGDの存在下で最大化されているという事実に起因⁺ MGD複雑なのFe ²準備のために採用されているのに加え。 NO-のFe ^{3 +が} -MGD形成されたので^、+-MGDは必要ありませんFe ^{2 +を}安定させるために溶液中でアスコルビン酸は内因性アスコルビン酸、ヒドロキノン、または最大の変換効率を持つシステイン⁺ MGD EPR検出可能なNO-Feの²に削減され99.9％...のFe ²低スピン反磁性の状態が⁺ NO）低温装置を必要とせずにフラットセルまたはキャピラリーチューブを用いた ¹⁵ の検出することができます 。
4. よくスワール得られた懸濁液を、4.6μを追加するカルシウムイオノフォアのL（CAI）（1ミリリットルのDMSOに1mgを溶解することにより1.9 mMのストック溶液から調製）。
5. スワール再びソリューションと37℃36分のためにCをさらにNO-Feの³の削減を可能にするためには、EPR検出可能なNO-Fe ^{2 +の} -MGDに⁺ MGD。
6. エッペンドルフチュー​​ブとEPRフラットセル（または50μlのキャピラリーチューブへの）への転送の上清（425μl）を収集します。
7. EPR取得パラメータは以下のとおりです。マイクロ波周波数：9.8 GHzの、中央のフィールド：3427 G;変調振幅：6.0 G、掃引幅：100 G;レシーバゲイン：1×10 ^5、マイクロ波電力：10 mWで、スキャンの総数：121;掃引時間：10秒、および時定数：20ミリ秒（注：パラメータはひとつの楽器と実験条件ごとに異なりますので、したがって、唯一のセンターフィールド周波数と変調振幅が考慮すべき最も重要なパラメータである。）
8. 室温でのスペクトルを記録し、2次元スペクトルは、INTEGたブルカーWinEPRデータ処理ソフトウェアやその他のデータ処理ソフトウェアを用いて補正し、バックグラウンドノイズやベースラインを減らすために評価した。付加体形成の定量化については、濃度対信号強度（又は面積）の標準的なプロットは、NOドナーSNAPを使用しない構築することができます。

2B。 eNOSのアンカップリング実験

1. インキュベーターから6ウェルプレートを取り外し、第2ウェルから培地を吸引し、1 mlのDPBSで2回洗浄する。
2. ペルオキシナイトライトのドナー、5 -アミノ-3 - （4 -モルホリニル）-1,2,3 - oxadiazolium塩化物（SIN-1）はeNOSの^16を切り離すために使用された。 0.5mMのSIN-1（M _R 206.6たてないのCa / Mgのイオンを含むPBS 500μlの1 mgのSIN-1を溶解して調製10mMストック溶液からg /モル）、希に2ミリリットルのDPBSの100μlを加えおよび10％FBS。
3. 37℃で2時間インキュベート℃、5％CO _2。
4. インキュベーターからプレートを削除し、DPBSで2回洗浄する。
5. 210μlを加え2.8mmでのFeSO _{4·7H 2} O、19.6 mMの210μlを新たに上記の手順に従って調製MGD。
6. 渦解と1.9 mMのCAIの4.6μlを追加します。
7. スワール再びソリューションと36分間37℃でインキュベートする。
8. エッペンドルフチュー​​ブとEPRフラットセルへの転送の上清（425μl）を収集します。
9. EPR取得パラメータは以下のとおりです。マイクロ波周波数：9.8 GHzの、中央のフィールド：3427 G;変調振幅：6 G;掃引幅：100 G;レシーバゲイン：1×10 ^5、マイクロ波電力：10 mWで、スキャンの総数：121;掃引時間：10秒、および一定時間：20ミリ秒。
10. スペクトルを記録し、2次元スペクトルは、前述したように補正し、バックグラウンドノイズやベースラインを減らすために統合されました。

3。 O ₂の検出• -多形核好中球からの（多形核白血球）

1. 以前に^17に記載^のよう^に好中球は、ヒトの血液サンプルから単離された。
2. ジエチレントリアミン5酢酸（DTPA）は0.1mMを含むPBSで1 M DMPO *のストック溶液を作成します。 DMPOは、25から29の融点を有する°C、それがガラスバイアル（注に液体DMPO（密度〜1.02グラム/ mlの25℃）ピペッティングする方が便利ですので、：純粋なDMPOので、計量プラスチックバイアルを使用しないでください。 ）プラスチックと反応します 。凍結DMPOは、バイアル（：DMPOが分解可能性があるのでお湯を実行しないでください注）へとルーク温水を実行することによって溶融させることができる。
3. それ以来、高純度DMPOを（> 99％）を使用することが重要である市販のスピントラップの一部は、常磁性不純物を含んでおり、したがって、それは単独でだけDMPO溶液のEPRスペクトル（このケースでは10 mM）を実行することが不可欠です。それはバックグラウンド信号（ 図3Aを参照）は明らかではないことが重要です。
4. DMSO中のホルボール-12 - ミリステート-13 - アセテート（PMA）のストック溶液（1 mg / ml）を準備します。 PBSで10μg/ mlの解決策を希釈することにより、アリコートを行います。
5. 1。5ミリリットルエッペンドルフチューブには、添加の順序に従うことによって0.6ミリリットルの合計体積で解決策を準備します。PMNのmlあたり〜10 ⁶細胞、D-グルコース（1 mg / ml）とアルブミン（1 mg / ml）を、10 mMのDMPOとPMA 0.2μg/ mlの。（注：PMAは、急進的な活性化因子であると最後に追加する必要があります）。
6. EPRフラットセルに溶液を移します。
7. EPR取得パラメータの条件は次のとおりです。マイクロ波周波数：9.8 GHzの、中央のフィールド：3486 G;変調振幅：0.5 G、掃引幅：100 G;レシーバゲイン：5×10 ^5;スキャンの総数：10;掃引時間：30秒、マイクロ波電力：20 mWで、そして一定時間：81 msです。付加体形成の定量化については、濃度対信号強度（または地域）の標準的なプロットは、そのようなテンポや-3 - カルボン酸-PROXYLとして安定したニトロキシドを用いて構築することができます。

DMPOの利用に関する重要な注意：フラットセルを使用することにより、一つの細胞密度を高め、それによって信号を増加させることができスピンアダクトの強さがO ₂の半減期• - DMPOの付加物が短い（T _1/2〜1分）DMPO-OHに分解する。 DMPOは、t _1/2〜8とそれぞれ14分、と増加した付加物の安定性のために市販されているEMPO、BMPOまたはDEPMPOの同じ濃度を用いて置換することができます。

4。代表的な結果

のFe ²からのEPRシグナルを示していない⁺ MGD又はFe ²の混合物は、CAIと^+-MGDバックグラウンド信号があり、これらの試薬 ​​に由来しないことを示すラジカル⁺ MGD 図2Aおよび2BのFe ^2を用い^て行われたNOのスピン捕捉。のFe ²と反応してCAIのリリースNO刺激によりBAECスピン付加物を形成するために^+-MGD、NO-のFe ^{2 +-MGD}と_、N = 12.66 Gの超微細分裂定数（HFSC）の値を持つ特徴的なトリプレット信号を示し、 G = 2.040のg因子。 （ 図2C）。 HFSC値は、NIEHS EPRソフトウェアデータベースのWebサイトからダウンロードすることができますWINSIMシミュレーションプログラムを用いて決定した。実験的なHFSCは、NO-のFe ^{2 +-MGD}付加のために_N = 12.70 Gとg = 2.041 ¹⁸の文献値と一致しています。同様に、BAEC上にSIN-1の効果は、 図2Dに示すように、eNOSのは、脱共役によるNO産生を低下させません。

検出- DMPOスピントラップは、O _2•使用されました。スピントラップは常磁性不純物から自由であることを確認し、図3Aに示すように、DMPOは、単独でシグナルを与えなかった。 図3Bは、唯一のDMPOとPMNのスペクトルであり、同様に、DMPOが発生しないことを示唆して検出可能なシグナルはありません酵素NADPHオキシダーゼの活性化を図3Cは、PMAによるPMNの刺激時に ​​観察されたEPR信号を示しています。この信号のHFSCの値は_、N = 14.71 _G、＆であると決定されたβ、-H = 11.40 _G、γ-H = 1.25 G、および_N = 14.3 _G、β-H = 11.7 Gと_γ-H = DMPO-O 1.3 G ¹⁹の文献値と一致している₂ H付加。

図1：EPRスピントラップを用いた好中球およびBAECからラジカルを検出するためのフローチャート。 （A）PMNはDMPOとPMAと混合し、得られた混合物は、データ取得のためのEPRフラットセルに転送されます。 （B）BAECは、プレート上に成長し、DPBSで洗浄した。スピントラップの_Fe（MGD）2 CAIと一緒に追加されました。溶液が十分に混合し、インキュベートした。混合物は、EPRのデータ取得のためのEPRフラットセルに移した。

図2 BからのNOのEPR検出AEC。のFe ^{2 +} MGD + CAIの（）のFe ²スペクトラム⁺ MGDのみ（B）スペクトルのみ。 （C）のFe ² NOトラップに起因するトリプレットスペクトルは^+-MGD CAI-刺激した細胞を使用します。 （D）スペクトルは、0.5 mMの細胞のSIN-1処理によるNO産生の減少を示している。

図3活性化好中球からのDMPO-O ₂ HのEPRを検出します。 10 mMのDMPOの（A）スペクトルのみ。 （B）の10 mM DMPOの存在下で単独でPMNのスペクトル。 （C）PMNのスペクトルは、10 mMのDMPOの存在下でPMAによって活性化。

ディスカッション

EPRスピントラップは、フリーラジカルを定量化し、識別するための生物医学アプリケーションの広い範囲で採用されている。スピントラッピングは、nMからこのように生物系のアプリケーションに適していμMの範囲の濃度でラジカルを検出することができる、非常に敏感である。常磁性の付加物の形成、NO-のFe ^{2 +-MGD}は、EPR を経由して NOの検出の基礎となっています。のFe ^2...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
フェノールフリーDMEM培地 高グルコース1X	GIBCO	31053
0.25％トリプシン-EDTA	GIBCO	25200
L-グルタミン	フィッシャー·サイエンティフィック	BP379-100
MEM非必須アミノ酸	GIBCO	11140
ウシ胎仔血清	アトランタバイオ	S11550
内皮細胞増殖因子	ミリポア	02から102
CAI	エンツォ生命科学	A-23187	DMSOに溶解
SIN-1	エンツォ生命科学	BML-CN245-0020
DMPO	同仁化学研究所	D048-10
のFeSO 4·7H 2 O	シグマアルドリッチ	215422-250G	CaとMgを含むPBSに溶解し
MGD	エンツォ生命科学	ALX-400-014-M050	のCa 2 +およびMg 2を含むPBSに溶解+
BAEC細胞	セルシステム	2B2-C75
DMSO	フィッシャー·サイエンティフィック	BP231-100
DPBS	シグマアルドリッチ	D8537
のCaCl 2とMgCl 2とDPBS	シグマldrich	D8662
ホルボールミリステートアセテート（PMA）	シグマアルドリッチ	79346-1mgの